一种核酸内切酶4介导的RNA特异扩增方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种核酸内切酶4介导的RNA特异扩增方法。本发明专利技术在传统一步法RT

【技术实现步骤摘要】
一种核酸内切酶4介导的RNA特异扩增方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种核酸内切酶4介导的RNA特异扩增方法。

技术介绍

[0002]RNA，核糖核酸，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T(胸腺嘧啶)。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。
[0003]与DNA相比，RNA种类繁多，分子量较小，含量变化大。RNA可根据结构和功能的不同分为信使RNA和非编码RNA。非编码RNA分为非编码大RNA和非编码小RNA。非编码大RNA包括核糖体RNA、长链非编码RNA。非编码小RNA包括转移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA(20
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300nt)包括miRNA、SiRNA、piRNA、scRNA、snRNA、snoRNA等，细菌也有小分子RNA(50
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500nt)。
[0004]然而，由于RNA自身的一些特性如片段长度短、序列相似度高、表达差异跨度大、环境背景复杂，使得其检测特别是单分子水平的定量分析存在重重挑战。例如，专利CN200810219765.9公开了用于RNA体外扩增的试剂及方法，包括连接物、引物、启动子和限制性内切酶等，达到了体外扩增RNA的目的，其所述目标RNA经过与连接物连接，在引物存在下进行RT
‑
PCR后得到扩增，再使用了茎环的结构形成了限制性内切酶的唯一位点，酶切所得产物在启动子启动下经过转录后可以得到除了5
’
端多一个G和少数3
’
端多一个A或C外与目标RNA样本完全一样的序列，所得的RNA产物与原样本RNA一样可以直接使用。专利CN202011429693.8则公开了一种免扩增的RNA定量检测方法，包括以下步骤：设计与目标RNA碱基互补配对且含5
’
端重复序列茎环结构的crRNA序列；配制Cas13反应体系；将待测物与所述Cas13反应体系混合，将该混合体系分散到大量尺寸均一且体积不超过纳升级的微反应单元，并提供适宜的温度条件孵育微反应单元；完成孵育反应后读取微反应单元信号，计算待测样品中目标RNA的含量；其所述的方法可实现单分子水平的RNA定量检测，无需内参校正和建立标准曲线，无需反转录及核酸复制步骤，也无需进行标记和功能修饰，恒温反应无需热循环，操作步骤简单且检测精度高。
[0005]RNA扩增技术目前主要有TMA及NASBA，当前并不普及，所用酶系(逆转录酶、T7 RNA聚合酶等)及检测体系较为复杂，稳定性欠佳，成本较高，应用较少。与之相反，RT
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PCR技术成熟，普及率高，缺点是不能区分模板中的DNA与RNA。在一些对RNA检测有特殊要求的项目如HBV RNA、HPV RNA、CT、NG、UU、MG、MH等的检测中，不能使用，例如专一性检测RNA而不检测其相应DNA，使用RT
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PCR方法很难实现，其扩增产物是起始RNA、起始DNA共同的扩增结果。因此，亟需提供一种灵敏度与准确性好，仅扩增RNA，不扩增DNA的RNA特异扩增方法

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中的上述问题，本申请提供了一种核酸内切酶4介导的RNA特异
扩增方法。本专利技术在传统一步法RT
‑
PCR的特异性逆转录引物的基础上进行修饰引物，选择性扩增RNA而不扩增相应的DNA。本专利技术所述的方法具有较好的灵敏度和准确性，且操作简单，适用于大规模工业化生产或检测。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一方面，本专利技术提供了一种RNA特异扩增方法，所述的方法为采用核酸复制修复酶及反转录基因特异性引物扩增RNA。
[0009]具体地，所述的核酸复制修复酶为不耐热的核酸内切酶4。
[0010]具体地，所述的反转录基因特异性引物含有通用标签序列、四氢呋喃(THF)、3
’
端封闭修饰。
[0011]进一步具体地，所述的3
’
端封闭修饰包括但不限于磷酸封闭、C3 Spacer封闭或双脱氧碱基封闭。
[0012]进一步具体地，所述的反转录基因特异性引物含有与检测的RNA互补结合的位点。
[0013]具体地，所述的方法采用的RNA特异扩增程序为逆转录37
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55℃5
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30min，预变性95℃1
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10min，95℃1
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15秒、60℃5
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60秒，热循环35
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50次。
[0014]在某些实施例中，本专利技术所述的RNA特异扩增方法使用反转录基因特异引物为逆转录引物，该逆转录引物的特点是，5
’
端含有通用标签序列，后续序列为待检RNA互补的RT引物，且其中间含有四氢呋喃(THF)修饰位点，相当于一个脱碱基位点(AP位点：可被生物体内修复酶如核酸内切酶4或核酸外切酶3所切割)，最后的1
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20个碱基，优选3
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15个碱基，与模板上的核酸互补，末端封闭处理，可以是磷酸化，也可以是C3 Spacer等，同时体系中加有不耐热的核酸内切酶4与通用引物。
[0015]另一方面，本专利技术提供了一种HCV RNA检测引物组合物，所述的引物组合物包括：
[0016]UTS(SEQ ID NO.1):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCT；
[0017]HCV
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MUTS(SEQ ID NO.2):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTctcatgdtgcacggtctacgTHF
‑
gac
‑
C3Space；
[0018]HCVF(SEQ ID NO.3):GYGTTGGGTYGCGAAAGG；
[0019]HCVP(SEQ ID NO.4):CY5
‑
TGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTT
‑
BHQ2。
[0020]又一方面，本专利技术提供了上述引物组合物在制备检测HCV RNA产品中的应用。
[0021]具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。
[0022]又一方面，本专利技术提供了一种检测HCV RNA的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。
[0023]具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。
[0024]具体地，所述的产品还包括PCR反应液。
[0025]又一方面，本专利技术提供了一种HPV16和HPV18 RNA检测引物组合物，所述的引物组合物包括：
[0026]UTS(SEQ ID NO.1):ATC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA特异扩增方法，其特征在于：所述的方法为采用核酸复制修复酶及反转录基因特异性引物扩增RNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的核酸复制修复酶为不耐热的核酸内切酶4。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的反转录基因特异性引物含有通用标签序列、四氢呋喃THF、3
’
端封闭修饰。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的3
’
端封闭修饰为磷酸封闭、C3 Spacer封闭或双脱氧碱基封闭。5.一种HCV RNA检测引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物包括：UTS:ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCT；HCV
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MUTS:ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTctcatgdtgcacggtctacgTHF
‑
gac
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C3Space；HCVF:GYGTTGGGTYGCGAAAGG；HCVP:CY5
‑
TGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTT
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BHQ2。6.权利要求5所述的引物组合物在制备检测HCV RNA产品中的应用。7.一种检测HCV RNA的产品，其特征在于：所述的产品包括权利要求5所述的引物探针组合物。8.一种HPV16...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹玉峰，郑冉，高青，
申请(专利权)人：山东见微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：