一种鉴定当归及常见当归混伪品的特异性引物对及其应用制造技术

本发明专利技术公开了当归特异引物对、PCR

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定当归及常见当归混伪品的特异性引物对及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种鉴定当归及常见当归混伪品的特异性引物对及其应用。

技术介绍

[0002]中药配方颗粒已完全失去了传统中药饮片的鉴别特征，其鉴别与监管已成为制约配方颗粒产业的瓶颈问题之一。由于生产、控制工艺的不同，中药配方颗粒缺乏统一可控的质量标准，在生产、流通、使用环节上未有有效监管，也导致了中药配方颗粒可能出现以伪充真、以次充好的现象，影响了配方颗粒的临床功效。2015年12月国家食品药品监督管理总局发布了关于征求《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》意见的公告(2015年第283号)，其中规定“应准确鉴定其物种，包括亚种、变种或品种，不同种的中药材不可相互混用”，为配方颗粒的质量控制问题提出了新挑战，亟需建立准确性高、稳定性好的方法用于配方颗粒原料物种的鉴定。
[0003]2021年4月29日，国家药监局发布了第一批160个中药配方颗粒国家标准，其中包括当归配方颗粒。中药配方颗粒国家标准以“标准汤剂”为基准衡量配方颗粒与饮片汤剂的“一致性”，建立量值传递数据表与特征图谱控制指标，实现配方颗粒质量专属性与整体性的综合管控。DNA分子鉴定技术对于近缘物种的区分更为有效，增加DNA分子鉴定方法有助于进一步提高配方颗粒物种基原专属性控制水平。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了当归特异引物对，所述当归特异引物对由核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA分子和核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA分子组成。
[0005]可选地，所述当归特异引物对中的核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA分子和核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA分子的摩尔比为1:1。
[0006]所述当归特异引物对可以用于鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种。
[0007]本专利技术还提供了用于鉴定当归的试剂，包括上述的当归特异引物对和限制性核酸内切酶SmlI。
[0008]所述试剂可以用于鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种。所述试剂可为PCR
‑
RFLP试剂。
[0009]本专利技术还提供了用于鉴定当归的试剂盒，包括上述的当归特异引物对和限制性核酸内切酶SmlI，或包括上述的试剂。
[0010]所述试剂盒可以用于鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种。所述试剂盒可为PCR
‑
RFLP试剂盒。
[0011]上文中，所述当归特异引物对和限制性核酸内切酶SmlI均可独立包装。
[0012]上述的当归特异引物对、上述的试剂或上述的试剂盒的应用也在本专利技术保护范围内。
[0013]该应用为如下A1)
‑
A8)任一种中的应用：
[0014]A1)在鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品中的应用，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种；
[0015]A2)在制备鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品的产品中的应用，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种；
[0016]A3)在鉴定或辅助鉴定当归中的应用；
[0017]A4)在制备鉴定或辅助鉴定当归的产品中的应用；
[0018]A5)在鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有当归中的应用；
[0019]A6)在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有当归的产品中的应用；
[0020]A7)在制备鉴别当归配方颗粒真伪的产品中的应用；
[0021]A8)在鉴别当归配方颗粒真伪中的应用。
[0022]本专利技术还提供了一种检测或辅助检测待测样本是否为当归或是否含有当归的方法，所述方法包括如下步骤：
[0023]a1)采用上述的当归特异引物对对所述待测样本的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
[0024]a2)以SmlI酶切所述扩增产物，得到酶切产物；
[0025]a3)凝胶电泳检测所述酶切产物，根据检测结果按照如下确定所述待测样本是否为当归或是否含有当归：若所述酶切产物仅在100～200bp之间有单一DNA条带，则所述待测样本为或候选为当归，或者含有或候选含有当归；若所述酶切产物不为仅在100～200bp之间有单一DNA条带，则所述待测样本不为或候选不为当归，或者不含有或候选不含有当归。
[0026]具体地，上述方法中，所述不为仅在100～200bp之间有单一DNA条带分如下3种情况：
[0027]b1)没有条带；
[0028]b2)有多条条带。
[0029]具体地，上述方法中，所述PCR扩增采用的引物退火条件为60℃退火2min。
[0030]具体地，上述方法中，所述PCR扩增中采用的PCR反应程序为：95℃初始变性5min；95℃变性30s，60℃退火2min，72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸60min。
[0031]具体地，上述方法中，所述方法中PCR反应体系中模板DNA浓度为4.5～13.3ng/μL，Taq DNA聚合酶为2
×
M5 SuperFast Taq PCR MasterMix。
[0032]具体地，上述方法中，所述方法中酶切体系中SmlI限制性内切酶用量为5000U/30μL，酶切时间为60min。
[0033]本专利技术建立了可同时区分当归及常见当归混伪品欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种的PCR
‑
RFLP检测体系。
[0034]本专利技术的引物对、PCR
‑
RFLP试剂、PCR
‑
RFLP试剂盒准确、快捷，在鉴别当归与常见当归混伪品(欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、独活和/或当归属其他物种)方面，尤其是中药配方颗粒中是否含有当归，具有更高的准确性与适应性，具有重要的应用价值。
附图说明
[0035]图1为本专利技术当归特异性酶切鉴定引物设计图。
[0036]图2为本专利技术实施例1中PCR反应退火温度对当归特异性PCR
‑
RFLP鉴别结果的影响。图中，M：Trans 2K DNA Marker；As：当归；AsE：当归配方颗粒浸膏；AsG：当归配方颗粒；Lo：欧当归；Ad：白芷；Pp：前胡；Ap：独活；Asp：野当归；Ls：藁本；N：空白对照。
[0037]图3为本专利技术实施例1中PCR循环数对当归PCR
‑
RFLP鉴别结果的影响。图中，M：Trans 2K DNA Marker；As：当归；AsE：当归配方颗粒浸膏；AsG：当归配方颗粒；Lo：欧当归；Ad：白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.当归特异引物对，其特征在于：所述当归特异引物对由核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA分子和核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA分子组成。2.根据权利要求1所述的当归特异引物对，其特征在于：所述当归特异引物对中的核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA分子和核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA分子的摩尔比为1:1。3.用于鉴定当归的试剂，其特征在于：包括权利要求1或2所述的当归特异引物对和限制性核酸内切酶SmlI。4.用于鉴定当归的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的当归特异引物对和限制性核酸内切酶SmlI，或包括权利要求3所述的试剂。5.权利要求1或2所述的当归特异引物对、权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在如下A1)
‑
A8)任一种中的应用；A1)在鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品中的应用，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、和/或独活；A2)在制备鉴别或辅助鉴别当归及常见当归混伪品的产品中的应用，所述常见当归混伪品为欧当归、东当归、白芷、前胡、藁本、和/或独活；A3)在鉴定或辅助鉴定当归中的应用；A4)在制备鉴定或辅助鉴定当归的产品中的应用；A5)在鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有当归中的应用；A6)在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有当归的产品中的应用；A7)在制备鉴别当归配方颗粒真伪的产品中的应用；A8)在鉴别当归配方颗粒真伪中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁媛，蒋超，陈梓媛，华中一，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：