具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物制造技术

本发明专利技术提供了具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物及其制备方法。本发明专利技术还提供了编码所述抗体或混合物的核酸分子、含有该核酸分子的重组载体和重组细胞，以及所述抗体或混合物的检测和定量方法。合物的检测和定量方法。

【技术实现步骤摘要】
具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
[0001]本申请是申请日为2016年01月08日、申请号为201680005167.4、专利技术名称为“具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物”的中国专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及双特异性抗体或抗体混合物，以及所述双特异性抗体或抗体混合物的制备方法。本专利技术还涉及编码所述双特异性抗体或抗体混合物的核酸分子、含有该核酸分子的重组载体和重组细胞，以及所述双特异性抗体或抗体混合物的检测和定量方法。

技术介绍

[0003]单克隆抗体药物在近十五年内增长迅速，成为制药行业的成长点。自1996年起，一共有30个左右单抗药物被批准上市。其中有九个单抗药物年销售超过十亿美元。2010年单抗药物总销售超过300亿美元，并且年增长率超过10％。由于单克隆抗体的靶标特异性强，只能抑制单一靶点。而在多种疾病中，包括肿瘤，自体免疫，需要抑制多重信号通路来避免代偿效应。对于病毒感染疾病，由于病毒的高突变率，往往需要抑制多抗原位点来防止逃逸。因此，有以下几种备选方案可以解决此类问题。一种备选方案是使用多克隆抗体，或通过改造抗体Fc段获得异二聚体如双特异性抗体，至少可以对两个不同抗原或者同一个抗原的不同结合位点具有活性。还有一种方案是使用抗体混合物来治疗，抗体混合物可包含两种或更多种针对同一靶物上不同表位的抗体，或针对不同靶物的抗体的混合物。
[0004]双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAbs)是含有两个不同配体结合位点的免疫球蛋白分子。它取代了经典的抗体Fab两臂相同的序列，而是用两个不同的Fab序列，因此Y型两臂可以结合不同的抗原表位。双特异性抗体在癌症治疗中的应用已经被多篇文献所综述(Carter 2001；Chames and Baty 2009；Chames and Baty 2009)。BsAbs的一臂可以连接肿瘤细胞表面的相关抗原而另外一臂则可以触发免疫效应细胞进一步杀伤细胞，通过免疫体系来杀死癌症肿瘤细胞。
[0005]对于双特异性抗体的制备，早在90年代，Carter等人用“把手
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孔洞”(knob into hole)模型改造抗体重链的部分氨基酸，比较成功的实现了双特异性抗体(Ridgway,Presta et al.1996；Carter 2001)。然而在他们的研究结果中，“孔洞
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孔洞”模型对阻碍同二聚体的形成的能力仍然不够，依旧遗留了大概有5％的同二聚体。之后该研究组通过随机突变
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噬菌体展示等方法进一步提高异二聚体的含量，但也没有解决根本问题。
[0006]本专利技术的专利技术人通过电荷氨基酸相互作用网络修改Fc的CH3相关氨基酸来减弱区域自身相互作用(有利于形成同二聚体)并增强区域之间的相互作用(有利于形成异二聚体)，成功的解决了“把手
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孔洞”模型中5％同二聚体的残留，相关方法已经发表专利(公开号：CN 102558355A)。
[0007]相对异二聚体平台技术，混合抗体生产平台的发展相对比较早期。其中最受关注的是丹麦的Symphogen A/S公司的抗体混合物技术。该技术首先通过抗体筛选平台的筛选获得多个针对同一靶标的抗体，随后针对每个抗体分别进行细胞株构建。之后将不同细胞
摇瓶培养的种子液进行混合，最后进行混合物逐步扩大培养放大，并进行纯化工艺优化获得最终的产品。尽管使用这一方法通过培养多个细胞的混合群可以直接从一个重组生产过程中获得多个抗体，但在由于对混合细胞群培养的控制的难度，以及因此带来的放大生产的复杂性，使得该方案依然有一些潜在的问题。
[0008]本专利技术申请人通过对Fc部分进行突变，改变Fc直接相互作用，专利技术了一种用于在单一重组细胞中生成包含两种或多种同二聚体蛋白或抗体混合物的方法。该方案避免了混合细胞培养带来的工艺控制及放大的潜在困难，提供了一种更为经济有效的抗体混合物制备与生产方式。此方案也已发表专利(公开号：CN 103388013A)。
[0009]但不论上述哪种方法，在利用全抗体框架制备双特异性抗体或抗体混合物时，都可能出现轻链和重链之间错配的现象，进而影响抗体的活性，目前本领域比较成熟的方法是Roche(Genentech)开发的Crossmab，即通过对其中一组Fab进行轻链
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重链序列的互相替换来防止该轻链序列与另一组轻链
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重链之间的错配(专利号US20090162359,US20120164726)。此方法虽然能解决大部分的重链
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轻链错配问题，但是又会因为对重轻链序列进行人为改造而带来新的问题，如轻链的解离，聚体含量增加，以及对有些Fab序列，会对抗原表位的识别造成一些影响。
[0010]赫赛汀(Herceptin，也叫曲妥珠单抗，Trastuzumab)作为第一个在乳腺癌中显示有切实疗效的治疗性单抗，为人类的抗人类表皮生长因子受体2(HER2)单克隆抗体，它作用于乳腺癌细胞的HER2
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Neu表面蛋白，干扰癌细胞的生物学进程，最终致其死亡。赫赛汀(Herceptin)的主要适宜人群是HER2过度表达(免疫组化3+或者荧光原位杂交FISH阳性)的乳腺癌患者，而该人群约占所有乳腺癌患者的20～30％。
[0011]帕妥珠单抗(pertuzumab)是一种重组的单克隆抗体，与HER
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2受体胞外结构域Ⅱ区结合，抑制二聚体的形成，抑制受体介导的信号转导通路(Agus DB，Gordon MS，Taylor C，et al.2005)。这可能部分解释帕妥珠单抗抑制HER
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2低表达肿瘤生长的原因，而曲妥珠单抗与HER
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2受体的细胞外Ⅳ区结合，二聚体的形成不涉及Ⅳ区，因此曲妥珠单抗只对HER
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2过表达的乳腺癌患者有效。目前正在进行帕妥珠单抗治疗HER
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2低表达晚期乳腺癌的Ⅱ期临床研究。Baselga(Baselga J，et al.2007)等的研究显示帕妥珠单抗联合赫赛汀(曲妥珠单抗)对经治HER
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2阳性乳腺癌患者具有确凿的抗肿瘤活性。该研究显示1/5的患者对帕妥珠单抗治疗有效(肿瘤缩小或消失)，另外1/5的患者病情保持稳定达6个月以上。帕妥珠单抗治疗乳腺癌的III期临床试验结果显示，该药能极长延长ERBB2阳性转移性乳腺癌患者的无进展生存期。
[0012]日前，罗氏公司公布了一项最新实验的结果，该试验是一项评估采用帕妥珠单抗和赫赛汀(曲妥珠单抗)联合化疗(多西他赛)，来治疗早期原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌女性患者的疗效的II期新辅助治疗研究。美国癌症研究协会(CTRC
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AACR)在圣安东尼奥乳腺癌研讨会(SABCS)上发布的数据显示，在术前新辅助治疗中给予者两种抗体联合多西他赛治疗的乳腺肿瘤完全消失率(45.8％的病例完全缓解率)较赫赛汀联合多西他赛(29.0％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.双特异性抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述双特异性抗体或其抗原结合部分具有共同轻链，所述共同轻链是指两条轻链具有相同的序列；任选地，其中所述共同轻链的可变区的序列包含选自如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6中第1～107位氨基酸所示的序列和/或其重链可变区分别为帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链可变区，例如分别包含如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的序列。2.能够在一个细胞中正确产生的抗体或其抗原结合部分的混合物，所述混合物包括至少两种抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分具有共同轻链，所述共同轻链是指两条轻链具有相同的序列。3.HER2蛋白胞外区域的变体蛋白，其与野生型HER2蛋白胞外区域的序列相比，具有选自如下一组的突变：1)第558位谷氨酸的突变和第573位苯丙氨酸的突变；2)第288位丝氨酸的突变和第296位组氨酸的突变。4.一种根据两株针对不同抗原表位的单克隆抗体或其抗原结合部分制备双特异性抗体或其抗原结合部分的方法和/或制备包括至少两种单克隆抗体或其抗原结合部分的混合物的方法，其包括以下步骤：根据两株单克隆抗体的轻链序列得到能够分别与两株单抗重链结合的共同轻链序列，所述共同轻链是指两条轻链具有相同的序列，优选地，该共同轻链为其中一株单抗的轻链或者为其中一株单抗轻链的突变体。5.一种检测抗体或其抗原结合部分是否为双特异性抗体或其抗原结合部分和/或对其定量的方法，所述方法包括以下步骤：1)分别制备能够和双特异性抗体或其抗原结合部分中的抗原结合部分1结合而不和抗原结合部分2结合的特异性抗原1，以及能够和抗原结合部分2结合而不和抗原结合部分1结合的特异性抗原2；2)取特异性抗原1(或者特异性抗原2)包被酶标板，加入待检抗体，反应一段时间，再加入标记的特异性抗原2(或者特异性抗原1)，反应一段时间，最后加入能够与前述标记分子结合的检测分子，反应一段时间，所述检测分子带有可检测的标记，根据检测原理读数，判断为反应阳性或阴性；3)当反应为阳性，并且该反应具有浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐霆，须涛，汪皛皛，李倩，逄敏洁，张慧敏，韩莉，张庆青，
申请(专利权)人：江苏康宁杰瑞生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：