抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体及其应用。杂交瘤细胞株LMBV

【技术实现步骤摘要】
抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术属于免疫学和病毒学交叉
，具体涉及一种具有能特异识别病毒主要衣壳蛋白的抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]大口黑鲈又名加州鲈，是一种淡水鱼类，属鲈形目，鲈亚目，太阳鱼科，黑鲈属，是我国近年来养殖规模发展最为迅速的品种之一。据《中国渔业统计年鉴》统计的数据，2020年全国鲈鱼总产量达到61.95万吨，已成为我国第十大淡水鱼类养殖品种。但随着养殖规模的扩大、养殖密度的增加、养殖模式的单一化及养殖环境的恶化，鲈鱼的病害问题日益凸显。其疾病主要包括病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫性疾病和真菌性疾病。 其中病毒性病原中，虹彩病毒和弹状病毒是最重要的两种病原。大口黑鲈虹彩病毒（Largemouth bass virus，LMBV）是一种胞质型双链DNA病毒，属于虹彩病毒科蛙病毒属。LMBV感染加州鲈引起的典型症状为：昏睡、体内外出血和脏器肿大等。LMBV主要感染仔鱼和幼鱼，导致死亡率超过80%，是加州鲈养成过程中最重要的病毒性病原，造成重大的经济损失。
[0003]目前对于大口黑鲈虹彩病毒尚缺乏有效的治疗方法和防控措施，早期检测和诊断是预防该病疾病爆发的关键环节。利用特异性强的单克隆抗体开发针对大口黑鲈虹彩病毒的检测技术，不仅具有快速、灵敏的优点，也适合现场大规模检测应用。另外，制备的单克隆抗体还可应用于病毒感染致病的研究中，包括病毒基因在宿主体内或体外培养细胞中的表达、定位、抗病毒功能制品筛选及病毒感染致病机理等。主要衣壳蛋白（major capsid protein，MCP）不仅是虹彩病毒的核心基因，也是病毒的主要结构蛋白。通常利用病毒的MCP序列同源性可以对病毒进行分类和检测。尽管国内已经制备了多种鱼类病毒或病毒蛋白的单克隆抗体，但是尚未有大口黑鲈虹彩病毒MCP单克隆抗体制备及应用的相关文献与专利。因此，抗大口黑鲈虹彩病毒MCP单克隆抗体亟待研制。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一个目的是提供能产生抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LMBV
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MCP
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8B10 2G6 ，其于2021年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO：C202208。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体，其是由杂交瘤细胞株LMBV
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MCP
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8B10 2G6 产生。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供上述抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体在制备检测大口黑鲈虹彩病毒LMBV MCP蛋白抗原试剂中的应用。
[0007]优选，是抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体在制备检测大口黑鲈虹彩病毒LMBV试剂中的应用。
[0008]优选，是抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体在用于体外感染细胞中MCP的定
位的试剂中的应用。
[0009]优选，所述的试剂可以是胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。
[0010]本专利技术的第四个目的是提供一种检测虹彩病毒LMBV MCP蛋白抗原试剂，其含有抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体。
[0011]本专利技术以纯化的LMBV MCP原核表达产物为抗原，免疫BALB/c小鼠，经细胞融合，产生融合的杂交瘤细胞，经间接酶联免疫反应（ELISA）筛选，获得稳定分泌抗LMBV MCP单克隆抗体8B10 2G6的杂交瘤细胞株。免疫印迹法结果显示, 本专利技术的单抗具有很好的特异性，不仅能特异性识别LMBV MCP原核表达产物，也能检测感染细胞中的病毒MCP。间接免疫荧光显示，本专利技术的单抗8B10 2G6可与感染LMBV的加州鲈鳍条细胞发生特异性反应，荧光信号在感染早期的细胞中主要分布在细胞质，感染晚期主要定位与病毒加工厂中。本专利技术中LMBV MCP的单抗的成功制备为LMBV免疫学检测方法的建立、抗病毒免疫制剂、病毒感染致病机理的研究奠定了基础，也可用于对LMBV MCP在体内外的定量和定位分析。
[0012]杂交瘤细胞株LMBV
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MCP
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8B10 2G6 ，其于2021年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO：C202208。
附图说明
[0013]图1为纯化的重组LMBV MCP蛋白的SDS
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PAGE电泳图。其中的a表达的是重组LMBV MCP蛋白在上清和沉淀中的分布，M.蛋白质分子量标准；其中的b表达的是纯化的重组LMBV MCP蛋白，M.蛋白质分子量标准；1. 纯化的重组LMBV MCP蛋白。
[0014]图2为杂交瘤阳性细胞的免疫印迹法筛选。M.蛋白分子量标准；1. 杂交瘤细胞5D10培养上清；2. 杂交瘤细胞7F1培养上清；3. 杂交瘤细胞8B10 2G6培养上清；4. 杂交瘤细胞8C4培养上清。
[0015]图3为纯化的单克隆抗体SDS
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PAGE鉴定。M.蛋白质分子量标准；1.纯化的单克隆抗体。
[0016]图4为纯化的单克隆抗体对病毒感染细胞MCP蛋白的免疫印迹分析图。M.蛋白质分子量标准；1. LMBV感染细胞。
[0017]图5图为LMBV MCP单克隆抗体对病毒的特异性识别检测。SPIV：sea perch iridovirus，海鲈虹彩病毒；SGIV，Singapore grouper iridovirus，石斑鱼虹彩病毒；LMBV，大口黑鲈虹彩病毒；Mock，模拟感染。
[0018]图6为利用纯化的单克隆抗体通过间接免疫荧光技术观察LMBV感染细胞中MCP的定位。
具体实施方式
[0019]为了更加简洁明了的展示本专利技术的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本专利技术做进一步的详细描述。
[0020]实施例1: LMBV MCP原核表达重组质粒的构建与蛋白表达（1）根据实验室测序的LMBV的全基因组中的MCP序列的信息，在金开瑞生物公司合
成该基因的开放阅读框的序列（其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：ATGAGCAGCGTTACCGGTAGCGGTATTACCAGCGGTTTTATTGATCTGGCAACCTATGATAGCCTGGATAAAGCACTGTATGGTGGTAAAGATGCAACCACCTATTTTGTGAAAGAACATTATCCGGTTGGCTGGTTTACCAAACTGCCGACCGCAGCAACCAAAACCAGCGGTACACCGGCATTTGGTCAGCATTTTAGCGTTGGTGTTCCGCGTAGCGGTGATTATGTTCTGAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株LMBV
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MCP
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8B10 2G6 ，保藏编号为：CCTCC NO：C202208。2.一种抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体，其特征在于，是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株LMBV
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MCP
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8B10 2G6 产生。3.权利要求2所述的抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV的单克隆抗体在制备检测大口黑鲈虹彩病毒LMBV MCP蛋白抗原试剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓红，黄友华，张泽妙，秦启伟，杨家辉，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：