一种白菜小孢子超低温冻存及复苏和诱导获得胚状体的方法技术

本发明专利技术涉及植物细胞培养技术领域，公开了一种白菜小孢子超低温冻存及复苏和诱导获得胚状体的方法。本发明专利技术所提供的方法选择改良B5培养基为冷冻保护剂，将所述白菜小孢子收集提取并分装到冻存管中进行超低温保存，保存温度为

【技术实现步骤摘要】
一种白菜小孢子超低温冻存及复苏和诱导获得胚状体的方法


[0001]本专利技术涉及植物细胞培养
，具体涉及一种白菜小孢子超低温冻存及复苏和诱导获得胚状体的方法。

技术介绍

[0002]超低温保存是指以液氮为冷源，储存温度保持在
‑
196℃的长期储存生物材料的方法。在如此低的温度下，保存的生物材料活体细胞的物质代谢几乎完全停止，处于“活力停滞”(Stagnant vitality)状态。在“活力停滞”状态下，细胞、组织及器官在低温保存过程中不会引起遗传特性的改变，从而可减缓甚至停止生物材料的新陈代谢和老化过程，达到不发生遗传变异、维持生物材料高活力的情况下延长储存材料的寿命，从而安全、有效地长期保存珍稀种质资源的效果。
[0003]超低温保存技术最初使用及推广主要针对动物细胞的保存，如动物的精子、卵子、胚胎的保存等。1973年Nag和Street首次成功地利用液氮保存胡萝卜悬浮体细胞，使超低温保存技术在植物保存上有了突破性的进展。因该方法所需空间小、投入少，能高度维持细胞的遗传稳定、且保存后生物材料活性好等优点，该技术逐渐在植物学领域受到广泛关注。目前，利用超低温保存的植物材料涉及原生质体、愈伤组织、花粉、种子、胚状体、植物枝条等，并在植株再生繁殖获得了有效的应用，但植物的小孢子超低温保存还未见报道。
[0004]植物的雄配子体培养是利用处于单核靠边期的小孢子受逆境胁迫诱导，发生发育途径的逆转进而生成胚状体。该技术是植物获得单倍体或DH材料的有效方法。自Sato(1989年)首次成功利用大白菜游离小孢子培养获得胚状体及再生植株，有力推动了十字花科芸薹属作物单倍体培养技术的快速发展，目前该技术是十字花科芸薹属植物诱导双单倍体(DH系)构建DH永久群体，并应用DH材料开展植物遗传研究的图谱构建、重要基因定位和加速育种亲本纯化的有效途径之一。
[0005]目前，对小孢子培养体系的不断优化，推动了该技术在科研相关领域的更多应用，但在植物细胞培养范畴，优质高活力的小孢子收集获取及应用时期受到供体植株的生长季节和栽培条件的极大影响。如两年生的大白菜，利用温室大棚等栽培条件，可在每年3～5月白菜开花期获得最佳诱导的小孢子，一旦进入高温季节，缺少人工气候室，大白菜植株无法继续正常生长，则严重影响小孢子的获取，使相关研究工作无法按计划推进。如何确保有活力的白菜小孢子持续的获取是推进白菜细胞工程研究面临的重要问题之一。利用超低温保存技术为妥善保存白菜小孢子提供了可能。收集提取白菜小孢子并维持长期保存和获得具高活力、具胚胎发生能力的小孢子，对推动并确保芸薹属单倍体诱导相关的细胞工程试验的顺利开展具实际意义。并对其他植物的小孢子保存提供了参考。

技术实现思路

[0006]为解决白菜这种两年生作物开展单倍体培养研究中小孢子因季节、栽培条件等限制因素而无法周年收集获得小孢子的困难，本专利技术的目的是提供一种白菜小孢子超低温冻
存及复苏和诱导获得胚状体的方法，本专利技术提供的技术方案如下。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种白菜小孢子超低温冻存及复苏和诱导获得胚状体的方法，包括：白菜小孢子的收集和分离、采用改良B5 培养基作为冷冻保护剂进行冷冻保存；所述改良B5培养基中包含常规 B5培养基组分、120
‑
140g/L蔗糖和30
‑
50g/L甘露醇，改良B5培养基pH 为5
‑
5.5。
[0008]在本专利技术提供的方法中，冷冻保存的白菜小孢子在35
‑
38℃处理38
‑
42s进行复苏。
[0009]本专利技术提供的白菜小孢子超低温冻存及复苏和诱导获得胚状体的方法，包括：利用改良B5培养基为冷冻保护剂，将所述白菜小孢子分装于0.5ml冻存管中进行超低温保存，保存温度为
‑
80℃。复苏条件为以0.5ml冻存管保存小孢子在37℃恒温水浴加热40s溶解复苏。对复苏后的白菜小孢子参照游离小孢子培养体系进行诱导启动获得胚状体。诱导获得胚状体转入改良B5固体培养基进行组织继代，直至获得具根、茎、叶的组培再生植株。
[0010]采用本专利技术提供的方法，可以实现冷冻保存6个月的白菜小孢子仍具高活力，平均活力可达80％～85％，并保持胚胎发生能力。复苏小孢子经游离小孢子培养仍可诱导获得胚状体。具体步骤如下。
[0011]在本专利技术提供的方法中，白菜小孢子的收集和分离包括：选取白菜花蕾长度2
‑
3mm，收集主要处于单核靠边期的小孢子。
[0012]在本专利技术提供的方法中，将花蕾收集后，用酒精浸泡消毒花蕾，再用次氯酸钠溶液洗涤花蕾，无菌蒸馏水冲洗；向花蕾中加入改良 B5培养基，进行破碎处理。
[0013]更具体地，白菜供体植株种子于每年12月催芽，播种于直径10cm 苗碗，温室育苗培养，常规管理。培养植株幼苗于次年3月定植于大棚，供体植株通过冬季短期的营养生长并感应低温春化开始花芽分化抽薹开花。春季3月至6月供体植株盛花期收集适合小孢子诱导期的花蕾，一般选取花蕾长度2
‑
3mm，白菜小孢子处于单核靠边期为宜。
[0014]白菜小孢子的机械化提取是指，收集供体植株长度2
‑
3mm的花蕾，此时小孢子主要处于单核靠边期。用75％酒精浸泡消毒花蕾30s，再用7％次氯酸钠溶液洗涤15min，无菌蒸馏水冲洗3遍；然后加入B5改良培养基，采用细胞破碎仪(TOMY MS
‑
100R)收集提取小孢子。一般每40个花蕾收集于5ml离心管，细胞破碎仪3000r
·
min
‑1条件下破碎10s，进行小孢子的机械化提取。
[0015]在本专利技术提供的方法中，破碎处理后，离心取上清，将小孢子沉淀分装于冻存管中，小孢子体积不超过冻存管的2/3，改良B5培养基作为冷冻保护剂，覆盖住小孢子沉淀，放于超低温冰箱中保存。
[0016]更具体地，本专利技术提取小孢子后离心去上清，加入改良B5培养基作为冷冻保护剂代替传统冷冻保护剂(二甲基亚砜等)，分装于 0.5ml灭菌冻存管，保存的小孢子体积不超过冻存管体积的2/3，冷冻保护剂刚覆盖住小孢子提取沉淀，确保冻存管密闭性并放于
‑
80℃超低温冰箱中保存。利用改良B5培养基作为小孢子超低温冷冻保护剂，可避免二甲基亚砜等传统冷冻保护剂对保存的组织材料带来的潜在毒害，冻存小孢子复苏后检测活力，高于以传统冷冻保护剂进行冻存的对照组。
[0017]在本专利技术提供的方法中，白菜小孢子的冻存温度为
‑
80℃或
ꢀ‑
196℃；优选地，所述冻存温度为
‑
80℃。
[0018]在本专利技术提供的方法中，白菜小孢子复苏后诱导胚状体的生成，包括：冻存复苏后
的白菜小孢子悬浮于NLN
‑
13液体培养基，血球计数板调整小孢子细胞悬浮液浓度为0.8
×
105/ml
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白菜小孢子超低温冻存及复苏和诱导获得胚状体的方法，其特征在于，包括：白菜小孢子的收集和分离、采用改良B5培养基作为冷冻保护剂进行冷冻保存；所述改良B5培养基中包含常规B5培养基组分、120
‑
140g/L蔗糖和30
‑
50g/L甘露醇，改良B5培养基pH为5
‑
5.5。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，冷冻保存的白菜小孢子在35
‑
38℃处理38
‑
42s进行复苏。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，白菜小孢子的收集和分离包括：选取白菜花蕾长度2
‑
3mm，收集处于单核靠边期的小孢子。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将花蕾收集后，用酒精浸泡消毒花蕾，再用次氯酸钠溶液洗涤花蕾，蒸馏水冲洗；向花蕾中加入改良B5培养基，进行破碎处理。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，破碎处理后，离心取上清，将小孢子沉淀分装于冻存管中，小孢子体积不超过冻存管的2/3，改良B5培养基作为冷冻保护剂，覆盖住小孢子沉淀，放于超低温冰箱中保存。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，白菜小孢子的冻存温度为
‑
80℃或
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李菲，谭舒心，张淑江，章时蕃，张慧，李国亮，孙日飞，李菊燕，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：