一种食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的快速检测方法技术

本发明专利技术提出一种食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的快速检测方法，步骤有：1、称取样品获得典型菌落；2、MALDI

【技术实现步骤摘要】
一种食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的快速检测方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，具体是一种食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的快速检测方法。

技术介绍

[0002]蜡样芽胞杆菌呕吐毒素(Cereulide，简称呕吐毒素)是由位于巨质粒上的Ces基因编码NRPS合成的一种环形的小分子肽，分子量为1153.38Da，含有L
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O
‑
Val
‑
L
‑
Val
‑
D
‑
O
‑
Leu
‑
D
‑
Ala三个氨基酸重复序列。该毒素无抗原性，耐热耐酸，在126℃、90min和pH2～12的条件下仍具有活性，对胰蛋白酶或胃蛋白酶，各种物理和化学因素不敏感，只有暴露在高碱条件或长时间暴露于高温高压环境中，才可以使Cereulide失活，是引发食物中毒常见一种毒素。该毒素在食物中预先产生且非常稳定，进入人体后在胃中与其受体结合，导致呕吐。研究发现在即食肉制品、乳制品、水产品、凉拌菜及各种生鲜食品中均有一定的检出率，最为典型的是米面制品。蜡样芽胞杆菌在食品中生长繁殖代谢产生呕吐毒素及一系列肠毒素，引起食用后食物中毒发生。其中只有一部分蜡样芽胞杆菌菌株能够产生热稳定的蜡样芽胞杆菌呕吐毒素，而呕吐毒素是蜡样芽胞杆菌引起食物中毒的主要原因。
[0003]目前，蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的检测方法主要有：1、PCR方法：通过测定产毒Ces基因进行区分，无法明确是否有毒素生产；2、化学检测法：主要有液相色谱
‑
质谱联用和液相色谱离子阱质谱等方法，对蜡样芽胞杆菌产毒株Cereulide生成量的测量，前处理复杂、基质效应大；3、动物试验法：半定性检测Cereulide的方法，不够准确，且费用高；4、生物检测法：有细胞空泡应答检验法和体外精子活力试验法，只能半定量检测Cereulide，且一般实验室很难开展。因此，非常有必要建立一套高效快速且灵敏度高的食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的检测方法，应用于食品安全监督检验、保障性检验及突发食品安全事件应急检验等领域。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提出一种食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的快速检测方法，其基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(简称MALDI
‑
TOF MS)分析方法，直接分析培养后获得的菌株，对呕吐毒素(Cereulide)进行定性鉴别，具有快速高效、灵敏度高和特异性强的特点。
[0005]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0006]一种食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的快速检测方法，其包括有以下步骤，
[0007]步骤1、称取样品适量，经接种、培养后获得典型菌落；
[0008]步骤2、用步骤1所得的典型菌落进行MALDI
‑
TOF MS检测；
[0009]步骤2.1、点样；
[0010]用1μL接种环对步骤1的典型菌落进行取样，取1至3个菌样分别点到靶板的1至3个微孔上，每个菌样对应1个微孔放置，同时在靶板上另外1个微孔上点1μL的PCS II标准溶液
和另外1个微孔上点1μL的Cereulide标准溶液，在靶板上形成3至5个点样微孔，之后室温放置，待点样微孔内的液滴干燥后，分别在点样微孔上先覆盖1μL 70％甲酸，待甲酸干燥后再覆盖1μL HCCA基质溶液，待HCCA基质溶液干燥后，进行MALDI
‑
TOF MS检测；
[0011]步骤2.2、仪器参数的设置；
[0012]选择正离子反射模式；检测范围：1000Da～2500Da；激光强度：30％；激光点击数：每图谱200次，8次激光累积；激光频率：2000.0Hz；离子源加速电压：20kV；采用速率：5.00GS/s；
[0013]步骤2.3、仪器校正；
[0014]进行质谱数据采集时，应先使用标准品对仪器的质荷比进行校准，确保质荷比误差范围小于0.0300％；
[0015]步骤2.4、数据采集及分析；
[0016]对待测菌样进行质谱数据采集并保存，采集的数据用flexanalysis软件进行分析鉴别，若存在m/z1175和m/z1191两个特征峰时，表明检测到待测菌样中含有呕吐毒素Cereulide的([M+Na]+
)和([M+K]+
)加合物，检测结果为阳性，说明样品中含有呕吐毒素Cereulide。
[0017]优化方案，本专利技术中步骤1的具体操作方式为，称取样品25g或25mL，加入225mL生理盐水均质后，作为1:10的样品匀液；吸取1:10的样品匀液1mL加入9mL生理盐水，充分混匀制成1:100的样品匀液，根据样品污染情况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液；根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液，每个适宜稀释度的样品匀液分别以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别涂布于3块MYP琼脂平板上、共计9块MYP琼脂平板，之后，待样品匀液吸收后，将上述9块MYP琼脂平板倒置于培养箱内，于30℃条件下培养12～18h，根据培养情况选取同一稀释度的3块MYP琼脂平板中上经培养后的典型菌落适量，进行步骤2的MALDI
‑
TOF MS检测。
[0018]优化方案，本专利技术中Cereulide标准溶液的浓度为1μg/mL，由Cereulide标准品采用纯乙腈稀释得到。
[0019]优化方案，本专利技术中HCCA基质溶液的浓度为10mg/mL，由HCCA粉末采用标准溶剂溶解得到，所述标准溶剂按照乙腈：水：三氟乙酸的体积比为50:47.5:2.5配制得到。
[0020]本申请人以不产呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌这3种常见菌株进行MALDI
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TOF MS检测，作为对比研究。具体是：分别采用本专利技术中步骤2的方法，在培养上述3种常见菌株得到这3种常见菌株的典型菌落后，参照本专利技术中步骤2的方法分别进行MALDI
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TOF MS检测。具体是：以1μL接种环取上述常见菌株培养的典型菌落，点到靶板的1个微孔上，同时在靶板的1个微孔上点1μL的PCS II标准溶液和另1个微孔上点1μL的Cereulide标准溶液，在靶板上形成3个点样微孔，之后室温放置，待点样微孔内的液滴干燥后，分别在3个点样微孔上先覆盖1μL 70％甲酸，待甲酸干燥后再覆盖1μL HCCA基质溶液，待HCCA基质溶液干燥后，进行MALDI
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TOF MS检测；检测结果如图5所示，图5中显示上述3种常见菌株在m/z1175和m/z1191都不存在特征峰，因此m/z1175和m/z1191这2个特征峰的存在可以用来鉴定呕吐毒素。
[0021]本专利技术具有以下突出的实质性特点和显著的进步：
[0022]1、本专利技术采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法，直接分析培养后获
得的菌株，对食品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的快速检测方法，其特征在于：包括有以下步骤，步骤1、称取样品适量，经接种、培养后获得典型菌落；步骤2、用步骤1所得的典型菌落进行MALDI
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TOF MS检测；步骤2.1、点样；用1μL接种环对步骤1的典型菌落进行取样，取1至3个菌样分别点到靶板的3个微孔上，每个菌样对应1个微孔放置，同时在靶板上另外1个微孔上点1μL的PCSII标准溶液和另外1个微孔上点1μL的Cereulide标准溶液，在靶板上形成3至5个点样微孔，之后室温放置，待点样微孔内的液滴干燥后，分别在点样微孔上先覆盖1μL 70％甲酸，待甲酸干燥后再覆盖1μL HCCA基质溶液，待HCCA基质溶液干燥后，进行MALDI
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TOF MS检测；步骤2.2、仪器参数的设置；选择正离子反射模式；检测范围：1000Da～2500Da；激光强度：30％；激光点击数：每图谱200次，8次激光累积；激光频率：2000.0Hz；离子源加速电压：20kV；采用速率：5.00GS/s；步骤2.3、仪器校正；进行质谱数据采集时，应先使用标准品对仪器的质荷比进行校准，确保质荷比误差范围小于0.0300％；步骤2.4、数据采集及分析；对待测菌样进行质谱数据采集并保存，采集的数据用flexanalysis软件进行分析鉴别，若存在m/z1175和m/z1191两个特征峰时，表明检测到待测菌样中含有呕吐毒素Cereulide的([M+Na]
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈楷，黄志深，林秀敏，宋安华，肖剑，雷燕，劳嘉倩，曹霞飞，蒋佳希，
申请(专利权)人：广州市食品检验所广州市酒类检测中心，
类型：发明
国别省市：