一种微生物单细胞代谢组学分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于MALDI质谱进行微生物单细胞代谢组学分析的方法，具体包括导电玻片表面阵列化、微生物细胞悬液在双蒸水中离心洗涤、微生物洗涤后梯度稀释、稀释后细胞液滴加于阵列化玻片指定位置并吹干、MALDI质谱操作等步骤。本发明专利技术克服了目前微生物单细胞前处理复杂，数据点间重复性差，数据采集图像定位不够准确的缺点，具有步骤简单，背景重复性高，定位准确，数据采集速度快，灵敏度高的优点。灵敏度高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种微生物单细胞代谢组学分析方法


[0001]本专利技术涉及质谱检测
，尤其涉及基于MALDI质谱的微生物单细胞代谢组学的前处理及数据采集方法。

技术介绍

[0002]单细胞代谢组学研究领域是当前系统生物学、分析化学的最前沿，该方法可以揭示微生物单细胞水平代谢异质性的成因,在单细胞水平进行精准代谢模型建立，以及探究肠道微生物稳态机制等，此外，单细胞代谢组学技术在癌症靶点筛选，精准医疗等方面均具有巨大应用潜力。
[0003]目前，用于单细胞代谢组学技术研发的质谱仪主要有基质辅助激光解吸电离技术(Matrix
‑
Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI)，二次离子质谱(secondary ion mass spectroscopy，SIMS)，电喷雾电离(Electrospray Ionization，ESI)三类，其中，MALDI质谱的仪器精度最符合高通量单细胞代谢组学方法的要求。
[0004]MALDI离子源是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和样本分析物膨胀并进入气相。可以通过对激光能量的调节来控制样本解吸程度；高分辨质谱如bruker solariX和solariX 2xR结合了最新磁共振质谱、和谐阱分析池和磁场离子轨迹控制技术，是实现超高的质量分辨率的先决条件，由此获得宽质量范围同位素精细结构(IFS)常规测定的结果。/>[0005]质谱成像(mass spectrometry imaging,MSI)是一种新型的成像技术,可在无标记的情况下同时检测并记录样品表面多种分子的空间分布信息。MSI的主要原理是将质谱与成像技术相结合,通过离子束或激光照射样品切片使其表面的分子离子化,经检测器获得质谱信号,再由成像软件将获得的数据转化成像素点并重构出目标化合物在组织表面的空间分布图像。MSI的样品制备包括样品收集与储存、组织切片、组织预处理、基质的选择与应用。目前,该技术已被广泛地应用于生物医学、新药研发以及蛋白质组学等领域,其在法医毒理学领域的应用也逐渐受到关注。
[0006]高通量，高精度的高效单细胞数据采集对于微生物代谢异质性的捕捉至关重要，然而，目前尚未有利用质谱成像技术在微生物领域进行单细胞代谢组学技术开发的先例，适用于微生物尺度的基质应用策略尚不完善，单细胞定位精度仍然不足，数据采集效率较低，这些因素极大的限制了单细胞代谢组学技术在微生物领域的应用。
[0007]因此，本领域的技术人员致力于开发一种样品前处理快，单细胞数据采集高效，准确，灵敏的基于MALDI质谱的微生物单细胞代谢组学的前处理及数据采集方法。

技术实现思路

[0008]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的旨在建立一种前处理快，单细胞数据采集高效、准确、灵敏的微生物单细胞代谢组学的前处理及数据采集方法。
[0009]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种微生物单细胞代谢组学分析方法，包括以下步骤：
[0010]S1、氧化铟锡导电玻璃片表面阵列化
[0011]使用激光蚀刻技术对氧化铟锡导电玻璃片进行基于定位引导图案的阵列化制备；
[0012]S2、微生物样品的前处理；
[0013]S3、细胞芯片的制备；
[0014]S4、进行MALDI质谱成像分析。
[0015]优选地，步骤S2包括：
[0016]S2.1、清洗：将含微生物的培养基取出，离心后弃上清，加入超纯水洗涤；
[0017]S2.2、稀释：对洗涤后的细胞液进行梯度稀释，制成细胞悬液并计数。
[0018]进一步，优选地，步骤S2.1中，离心转速为3000rpm，时长为5min。
[0019]进一步，优选地，步骤S2.2中，所述细胞悬液密度为100
‑
200个/uL。
[0020]优选地，步骤S3包括：取S2.2获得的细胞悬液滴加于步骤S1氧化铟锡导电玻璃片蚀刻点阵处中央位置，并放置于超净工作台吹干，完成细胞芯片制备，对细胞芯片进行显微拍照。
[0021]进一步，优选地，滴加的细胞悬液体积是0.5uL。
[0022]优选地，步骤S4包括：
[0023]S4.1、基质应用：对细胞芯片进行基质应用；
[0024]S4.2、阵列临摹：对应用基质后的细胞芯片表面蚀刻的图案进行基于微米级面积针头的临摹，而后完成第二次细胞芯片的成像；
[0025]S4.3、质谱成像：对第二次细胞芯片显微拍照图像进行单细胞标记，对细胞芯片进行非连续的质谱成像数据采集。
[0026]进一步，优选地，步骤S4.1中，基质应用采用的是基于升华法的基质涂布方法。
[0027]进一步，优选地，步骤S4.3中，所述非连续的质谱成像数据采集模式为fleximaging软件的tissue profiling模式，参数设置如下：漏斗射频幅度：150V；飞行时间＝0.9ms；传输光学频率＝4MHz；Q1质量：300m/z；射频幅度＝450Vpp；漏斗射频幅度＝150Vpp，质谱室恒温18℃，湿度保持在50％～60％。
[0028]本专利技术的第二个方面，提供上述方法在对微生物单细胞代谢物分析中的应用。
[0029]本专利技术克服了现有的化学基质应用重复性差，前处理冗长，数据采集低效的缺点，具有前处理快，单细胞数据采集高效，准确，灵敏的优点。
具体实施方式
[0030]实施例1基于MALDI质谱的莱茵衣藻单细胞代谢组学的前处理及数据采集方法包含以下步骤：
[0031]1、氧化铟锡导电玻璃片表面阵列化：使用激光蚀刻技术对氧化铟锡导电玻璃片进行基于定位引导的图案的阵列化制备；
[0032]2、清洗：实验过程中，将培养中的含有莱茵衣藻的TAP培养基取出2mL液体于2mL离心管中，3000rpm,5分钟离心后弃上清，加入超纯水洗涤；
[0033]3、稀释：对洗涤后的细胞液进行梯度稀释并通过显微镜检保证每微升细胞液中含
有100～200个单细胞；
[0034]4、预制备：手动滴加0.5uL细胞液于激光蚀刻点阵处中央后，将放置于超净工作台吹干，完成细胞芯片制备。对细胞芯片进行显微拍照。
[0035]MALDI质谱操作步骤如下：
[0036]5、基质应用：对细胞芯片进行基于基质升华法的基质应用；
[0037]6、阵列临摹：对应用基质后的细胞芯片表面蚀刻的图案进行基于微米级面积针头的临摹，而后完成第二次细胞芯片的显微拍照；
[0038]7、质谱成像：非连续的质谱成像数据采集。譬如使用fleximaging软件的tissue profiling模式。质谱室恒温18℃，湿度保持在50％～60％之间。仪器参数设置如下。漏斗射频幅度：150V；飞行时间＝0.9ms；传输光学频率＝4MHz；Q1质量：300m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物单细胞代谢组学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、氧化铟锡导电玻璃片表面阵列化使用激光蚀刻技术对氧化铟锡导电玻璃片进行基于定位引导图案的阵列化制备；S2、微生物样品的前处理；S3、细胞芯片的制备；S4、进行MALDI质谱成像分析。2.根据权利要求1所述的微生物单细胞代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S2包括：S2.1、清洗：将含微生物的培养基取出，离心后弃上清，加入超纯水洗涤；S2.2、稀释：对洗涤后的细胞液进行梯度稀释，制成细胞悬液并计数。3.根据权利要求2所述的微生物单细胞代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S2.1中，所述离心转速为3000rpm，时长为5min。4.根据权利要求2所述的微生物单细胞代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S2.2中，所述细胞悬液密度为100～200个/uL。5.根据权利要求1所述的微生物单细胞代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：取S2.2获得的细胞悬液滴加于氧化铟锡导电玻璃片蚀刻点阵处中央位置，并放置于超净工作台吹干，完成细胞芯片制备，对细胞芯片进行显微拍照。6.根据权利要求5所述的微生物单细胞代谢组学分析方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶飞，孟宣霖，许平，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：