本发明专利技术公开了一种碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法及应用。所述检测方法利用碳荧光微球良好的荧光特性，结合碳荧光微球标记技术和侧流层析技术，在优化实验条件的基础上，构建荧光侧流层析试纸条。试纸条进行检测后，采用碳荧光微球侧流层析检测测试带和质控带荧光信号强度，并以荧光强度得到积分面积的曲线，进而依据碳荧光微球侧流层析仪获取的标准曲线实现分析物的定量检测。本发明专利技术的检测方法具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明专利技术适用于夹心法和竞争法检测方法，分析物可以是小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物，可应用于食品安全、环境监测等诸多相关领域。相关领域。相关领域。
【技术实现步骤摘要】
一种碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法及应用
[0001]本专利技术涉及一种侧流层析检测方法，尤其涉及一种以优选材料为基础，利用碳荧光微球标记配体实现分析物定量检测的方法及相应的碳荧光微球侧流层析试纸条，特别公开了一种基于碳荧光微球的荧光免疫层析技术，可实现多种分析物的半定量与定量检测，属于荧光免疫检测
技术介绍
[0002]侧流层析技术(Lateral flow assay，LFA)于1960年代末首次出现，用于监测血清蛋白。1976年出现了第一个自制的LFA，以检测尿液中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)。该测试的原理基于抗体
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抗原特异性相互作用。从那时起，它就被广泛用于检测各种分子，例如癌症标志物，微生物，霉菌毒素，重金属和农药等。与常规分析方法相比，侧流层析技术具有低成本，易于操作，使用方便，现场响应，结果可视化等诸多优点。其中，胶体金免疫层析使用最广泛。胶体金因其化学稳定性高、比表面积大、成本低、容易制备等优点成为最常用的标记物，但存在灵敏度偏低、稳定性差的局限。因此，层析技术迫切需要开发新型的标记材料。
[0003]荧光因其更灵敏而在传感和成像领域受到广泛关注。一些发光标记材料，例如荧光/磷光微球、量子点微球、上转换发光微球等材料也逐渐被引入层析技术，其灵敏度高于胶体金试纸条。但是，仍然存在一些问题，如制备工艺复杂、成本高、稀土上转换发光材料的量子效率通常较低且需要特定的激光器光源。因此，开发制备简单、成本低、发光强的荧光微球具有重要的现实意义。
[0004]碳点(Carbon dots，CDs)又称碳纳米点，是一类尺寸小于10nm的零维荧光准球形纳米粒子。CDs的关键特性包括激发光/pH依赖性、化学稳定性、抗光漂白性和上转换荧光。与半导体量子点相比，CDs的低毒性和高生物相容性使其成为生物成像和化学生物传感中半导体量子点的有力竞争者。基于CDs的荧光分析由于具有灵敏度高、操作简便、成本低等优势，在分析检测领域具有巨大的应用潜力。目前，基于碳点的侧流层析技术已有报道，然而，此类CDs的荧光量子效率偏低，构建二氧化硅包被的微球时会存在自淬灭等问题，靶标检测灵敏度偏低。因而，制备高量子效率的碳荧光微球并应用于侧流层析标记与检测具有重要意义。
技术实现思路
[0005]本专利技术的主要目的就是提供一种及碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法及相应的荧光侧流层析试纸条，以克服现有侧流层析标记材料存在的部分不足。
[0006]本专利技术的另一目的还在于提供一种碳荧光微球在侧流层析检测领域中的应用。
[0007]为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
[0008]本专利技术实施例提供了一种非诊断目的的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法，其包括：
[0009]1)使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微
球；
[0010][0011]2)在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；
[0012]3)将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；
[0013]4)在层析膜上设有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与步骤3)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；
[0014]5)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性；
[0015]6)将步骤3)所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
[0016]本专利技术实施例还提供了一种荧光侧流层析试纸条，其包括：沿设定方向依次连接的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫设置于底板上，所述层析膜为弱荧光层析膜，所述层析膜上设置有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体。
[0017]本专利技术实施例还提供了一种产品，应用于待检测样品中待分析物的定量检测方法中，所述产品包括前述的荧光侧流层析试纸条，并且，所述的检测方法包括：
[0018]使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微球；
[0019][0020]在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；
[0021]将待分析物对应的抗体或适配体连接到碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；以及，
[0022]将所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的优点包括：
[0024]1)本专利技术公开了一种碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法以及应用，本专利技术的方法利用碳荧光微球良好的荧光特性，结合碳荧光微球标记技术和侧流层析技术，在优化实验条件的基础上，构建荧光侧流层析试纸条。本专利技术的检测方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏度高。与常用的胶体金免疫层析方法相比，本专利技术具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。同时，本专利技术采用的碳荧光微球材料的制备步骤简单，量子效率高，且表面富含氨基，可进行表面修饰；
[0025]2)本专利技术的检测方法适用于夹心法和竞争法(抗原
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抗体，适配体)检测方法，分析物可以是小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物，可应用于目标物质的定量检测、食品安全、环境监测等诸多相关领域。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1是本专利技术一典型实施方案中碳荧光微球的制备及其与抗体偶联示意图；
[0028]图2是本专利技术一典型实施方案中一种免疫层析试纸条的组装示意图；
[0029]图3是本专利技术实施例1中基于竞争法原理的碳荧光微球标记免疫层析技术及AFB1检测示意图；
[0030]图4是本专利技术实施例1中碳荧光微球的TEM图片；
[0031]图5是本专利技术实施例1中碳荧光微球的红外光谱图；
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于，包括：1)使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微球；2)在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；3)将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；4)在层析膜上设有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与步骤3)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；5)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性；6)将步骤3)所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。2.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于，步骤1)包括：使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺溶解于水中，并在80～220℃进行水热反应1～24h，制得碳荧光微球；优选的，所述碳荧光微球的粒径为3～200nm；优选的，所述结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺的摩尔比为1:0.1～1；和/或，所述碳荧光微球的发射波长为500～700nm。3.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤2)包括：采用丁二酸酐法在所述碳荧光微球的表面修饰羧基，反应为无水条件，溶剂包括DMF、二甲基亚砜、乙二醇、乙醇、丙三醇中的任意一种或两种以上的组合；和/或，步骤2)所获碳荧光微球的荧光发射波长为440～600nm。4.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤3)包括：采用化学交联将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；优选的，所述化学交联包括1
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乙基
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(3
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二甲基胺丙基)碳化二亚胺/N
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羟基琥珀酰亚胺活化偶联方法将待分析物对应的抗体或适配体与碳荧光微球进行反应，反应所选缓冲液包括2
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(N
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吗啉)乙磺酸溶液，pH值为4.5～7.5；优选的，所述方法还包括：活化羧基后用碱性物质调节pH值至7.0。5.根据权利要求4所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤3)中，所述待分析物对应的抗体或适配体包括抗原、半抗原、单克隆抗体、多克隆抗体或
适配体；优选的，所述抗体修饰的碳荧光微球中抗体包括抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，标记的能识别黄曲霉毒素B1的DNA链的序列如SEQ ID NO.1所示。6.根据权利要求5所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤4)中，基于抗原
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【专利技术属性】
技术研发人员：王宇辉，邓晨，郑建萍，
申请(专利权)人：中国科学院宁波材料技术与工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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