一种软骨藻酸毒素荧光微球免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种软骨藻酸毒素荧光微球免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用，属于食品安全检测技术领域。本发明专利技术提供的检测试纸条由依次连接并固定于底板上的样品垫、结合垫、设有检测线和质控线的层析膜以及吸水垫组成，其中检测线包被软骨藻酸毒素

【技术实现步骤摘要】
一种软骨藻酸毒素荧光微球免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种软骨藻酸毒素荧光微球免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]软骨藻酸(Domoic acid，DA)是记忆缺失性贝毒(Amnesia shellfish poisoning，ASP)的主要成分，是由海洋硅藻的拟菱形藻属(Pseudonitzschia)和菱形藻属(Nitzschia)产生的一种强烈的神经性毒素。文献显示DA竞争性地与谷氨酸受体结合后，导致细胞产生一系列的错误指令，从而导致神经细胞死亡或细胞坏死。DA可在鱼贝类体内富集，并通过食物链传递作用转移给高能量级的动物，造成动物死亡，或转移给人类。当人体内的毒素达到一定浓度即可产生呕吐、腹泻和腹痛等中毒症状，严重者能导致短期记忆功能的丧失，甚至导致死亡。据报道，在北美(加拿大和美国)、欧洲及亚洲(日本)等地发生了人或水生动物因误食被DA毒素污染的海产品，而引发的中毒事件。在我国，也有相关的疑似DA中毒事件的报道，并且最近有文献报道在中国海域的菱形藻可检测到DA毒素。目前，已有多个国家(包括加拿大、日本和部分欧洲国家)制定了DA的安全限量标准，为20μg/g贝肉。在我国，目前还未能形成健全的DA毒素安全性评价方案，及海产品中DA的安全限量标准。
[0003]目前，国内外有关于DA检测方法主要有小鼠生物检测法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法和色谱联用法等仪器分析方法。这类仪器分析方法准确、稳定、灵敏，但耗时、设备昂贵，前处理方法繁琐，需要专业人员操作，不适用于实际生产生活中。此外，快捷简便且灵敏的免疫检测技术是目前市场上应用最广泛的，主要有酶联免疫吸附法、免疫层析法等。其中根据酶联免疫吸附法(ELISA)的原理DA检测目前已经有相关专利报道，如中国专利申请号201010283454.6和中国专利申请号201210157875.3。相比较而言，免疫层析方法简单快速，结果直观，且不需要专业分析人员，特别适合现场监测。然而，目前的检测试纸条具有检测灵敏度低，且仅能定性检测，严重影响了市场应用。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种软骨藻酸毒素荧光微球免疫层析检测试纸条，兼具ELISA和胶体金试纸条的快速、稳定、操作简便的同时，具有较高的检测灵敏度。
[0005]本专利技术提供了一种软骨藻酸毒素荧光微球免疫层析检测试纸条，所述试纸条包括底板和由下向上依次粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸；
[0006]其中在层析膜上由下向上依次设置有检测线T和质控线C；所述检测线T包被有软骨藻酸毒素
‑
载体偶联物，所述质控线C包被抗软骨藻酸毒素抗体的抗体；
[0007]在结合垫上包被有荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体。
[0008]优选的，所述软骨藻酸毒素
‑
载体偶联物的包被浓度为0.5～1.5mg/mL。
[0009]优选的，所述抗所述荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体的抗体的包被浓度为0.5
～1.0mg/mL。
[0010]优选的，所述荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体的包被浓度为20～30μg/mg。
[0011]优选的，所述荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0012]以软骨藻酸毒素抗体和所述荧光微球在偶联活化剂作用下进行偶联反应，经封闭，得到以酰胺键共价结合的荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体。
[0013]优选的，所述偶联反应的温度为20～28℃；
[0014]所述偶联反应的时间为1～3h。
[0015]优选的，所述荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体的溶剂为pH7.4的PBS溶液。
[0016]优选的，所述试纸条还包括外壳；所述试纸条卡入外壳内；所述外壳上设置有观察窗，通过所述观察窗观察检测线和质控线。
[0017]本专利技术提供了所述检测试纸条的制备方法，所述层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0018]将样品垫在样品垫处理溶液中浸泡，晾干，得到处理后的样品垫；
[0019]将荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体溶液喷涂于结合垫上，得到喷涂抗体的结合垫；
[0020]在层析膜上分别用抗软骨藻酸毒素抗体的抗体和软骨藻酸毒素
‑
载体偶联物划线，形成质控线C和检测线T；
[0021]将处理后的样品垫、喷涂抗体的结合垫、划线后的层析膜和吸水纸依次粘贴在底板上，经裁剪，得到试纸条。
[0022]本专利技术提供了所述检测试纸条在检测食品或水产中软骨藻酸毒素中的应用。
[0023]本专利技术提供了一种软骨藻酸毒素荧光微球免疫层析检测试纸条，所述试纸条包括底板和由下向上依次粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸；其中在层析膜上由下向上依次设置有检测线T和质控线C；所述检测线T包被有软骨藻酸毒素
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载体偶联物，所述质控线C包被抗软骨藻酸毒素抗体的抗体；在结合垫上包被有荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体。本专利技术利用竞争法检测原理设置试纸条各部分组成，其中结合垫上包被的荧光微球是将荧光团通过包埋、共价键连接等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能，具有相对稳定的形态结构以及发光行为。在荧光染料标记技术的基础上，建立起荧光微球标记层析检测技术，兼具ELISA和胶体金试纸条的快速、稳定、操作简便等优点。同时与胶体金免疫层析技术相比，以免疫荧光微球作为检测标记物，还具有以下优点：(1)荧光微球层析技术由于使用的示踪物为荧光微球，在激发光的照射下存在一个信号放大的过程，所以其灵敏度较胶体金试纸条要高；(2)荧光微球检测试纸条能够通过荧光读数仪进行定量检测，能够有效提高免疫层析检测的灵敏度。实验表明，所述试纸条的检测限为0.5ng/mL。
[0024]同时所述试纸条标准曲线符合免疫学反应规律，定量检测范围为1.0～10.0ng/mL，试纸条IC
50
值为1.121ng/mL；所述试纸条与麻痹性贝毒的石房蛤毒素、腹泻性贝毒的软海绵酸、神经性贝毒的PbTx等交叉反应率均小于0.1％。所述试纸条检测DA阳性添加样品的回收率在93.6～106.6％之间，同一批次试纸条批内检测变异系数为7.5～14.6％，批间检测数据的变异系数为9.4～13.2％，表明该试纸条具有较好的准确度和精密度。
附图说明
[0025]图1为软骨藻酸荧光微球检测试纸条的结构示意图和检测结果示意图；其中，1为样品垫，2为结合垫，3为层析膜，4为底板，5为吸水垫，6为检测线，7为质控线；a为阴性，b为阳性，c和d为无效；
[0026]图2为软骨藻酸荧光微球检测试纸条检测的标准曲线图。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种软骨藻酸毒素荧光微球免疫层析检测试纸条，所述试纸条包括底板和由下向上依次粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种软骨藻酸毒素荧光微球免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板和由下向上依次粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸；其中在层析膜上由下向上依次设置有检测线T和质控线C；所述检测线T包被有软骨藻酸毒素
‑
载体偶联物，所述质控线C包被抗软骨藻酸毒素抗体的抗体；在结合垫上包被有荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体。2.根据权利要求1所述检测试纸条，其特征在于，所述软骨藻酸毒素
‑
载体偶联物的包被浓度为0.5～1.5mg/mL。3.根据权利要求1所述检测试纸条，其特征在于，所述抗所述软骨藻酸毒素抗体的抗体的包被浓度为0.5～1.0mg/mL。4.根据权利要求1所述检测试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体的包被浓度为20～30μg/mg。5.根据权利要求4所述检测试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记的软骨藻酸毒素抗体的制备方法，包括以下步骤：以软骨藻酸毒素抗体和所述荧光微球在偶联活化剂作用下进行偶联反应，经封闭，得到以酰胺键共价结合的荧光微球标记的软骨藻酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶剑敏，李扬，刘靖，李炳喜，郭政，陈建林，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：