缺失十二个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种缺失十二个基因的减毒非洲猪瘟病毒株及作为疫苗的应用。本发明专利技术在ASFV CN/GS 2018病毒中联合缺失G

【技术实现步骤摘要】
缺失十二个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种缺失十二个基因的减毒非洲猪瘟病毒株Δ20/M9的构建及其作为疫苗的应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2019年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁，其中与2018年8月相比，2019年9月中国生猪产量下降了40％，猪肉价格自2019年8月以来上涨了一倍，已造成全国40％以上减产率，损失严重。当前没有商品化的有效疫苗，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，无法满足我国规模化养猪的需要。因此，疫苗作为预防和控制病毒传染病最有效、最经济的手段，对于我国规模养猪模式下的非洲猪瘟的防治至关重要。但非洲猪瘟病毒(ASFV)结构复杂、基因组庞大，大部分功能未知，感染与致病机制不清，疫苗创制的理论认知有限，其流行已逾百年，但仍未有商品化的疫苗问世。
[0003]目前对于非洲猪瘟疫苗的制备主要通过三种方式：一是直接对原始非洲猪瘟病毒进行灭活得到灭活疫苗；二是筛选出有效诱导免疫应答的病毒蛋白，进而制备亚单位疫苗和活载体疫苗；三是采用基因缺失手段，敲除毒力基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用、最直接的方法，但是，由于非洲猪瘟病毒编码免疫抑制、免疫耐受和抗体依赖增强作用(ADE)等蛋白，灭活疫苗免疫猪内无法提供有效的免疫保护作用；第二种方面是非洲猪瘟病毒结构复杂，目前诱导免疫应答的蛋白还未清楚，获得的抗原还不足以诱导坚强的免疫保护作用。而目前最有望突破的疫苗就是基因敲除疫苗，通过对免疫抑制、耐受、ADE等毒力相关基因的敲除，获得既具有免疫原性，又能降低致病性，免疫猪获得免疫保护作用的疫苗候选毒株。
[0004]对于猪瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考虑到对猪的免疫应答和保护性，又要兼顾致病性和安全性能。但是现有技术中猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗还考量如下因素：(1)敲除的毒力基因是否减少带毒、排毒，是否带来组织损伤和影响生产性能等是生物安全的一个重要指标，也是基因缺失疫苗安全性不断提升的一个重要指标；(2)不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分存在毒力和致病性残留问题；以及多基因缺失造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险；(3)非洲猪瘟的全基因组测序工作虽然已经完成，但是组成非洲猪瘟病毒的调控基因和结构基因高达160多个，虽然工程巨大，但对调控基因和结构基因的功能对其致病机理和疫苗研制至关重要；(4)联合敲除毒
力基因的选择至关重要，不同选择配合会产生不同甚至相反的免疫保护效果。
[0005]因此，虽然毒力基因的敲除是构建非洲猪瘟减毒株的一种策略，但是在不同病毒中敲除相同的基因也会导致效果的显著差异，而且在联合敲除过程中毒力基因的选择也至关重要，并不是任意毒力基因的联合敲除均会实现减毒保护的功效。例如，
①
在不同种类的非洲猪瘟病毒中敲除NL基因(即DP71L基因)后获得肩部保护效果不同，其中，在E70NL基因的敲除所得非洲猪瘟病毒株的毒力完全消失；在Pr4中敲除NL基因，所得毒株Pr4
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ΔN
‑
SL在102TCID
50
剂量下，虽然延迟了猪死亡及发病时间，但是有接近86％的致死率，在Mal中敲除NL基因所得毒株Mal
‑
ΔNL仍保持极高的毒力，在102TCID
50
剂量下的致死率为100％；DP148R基因缺失的Benin 97/1株也能够使得病毒充分致弱，免疫猪后存活率也是100％，但DP148R基因缺失中国流行株免疫株后的存活率仅仅为0％；
②
虽然公开了将MGF 505/530家族基因与MGF360家族基因联合敲除能够产生一定的减毒保护作用，但是MGF360与MG F 505/530和B119L联合敲除时，不具有减毒保护作用；而在E70
△
NL(敲除NL基因的E70毒株)中联合删除MGF360/505的几个成员反而会导致减毒菌株(E70
△
NL)的毒性增强；
③
目前，公开较多的是CD2v与MGF
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360
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505家族基因的联合敲除，例如CD2v与MGF
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360
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12L、MGF
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360
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13L、MGF
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360
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14L的联合敲除、MGF
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505R基因全部缺失以及CD2v与MGF
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360
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505R全部基因的联合缺失；但是获得的减毒株虽然会提供一定的免疫保护效果，但是在对猪免疫后，猪血清里仍然能够检测到病毒的存在，安全性仍然存在问题；而且专利技术人研究发现MGF505
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7R、MGF110
‑
9L、DP71L和DP148R基因的联合缺失，构建的重组毒，免疫保护效果较差，保护率仅只有50％。
[0006]针对上述，本专利技术通过联合缺失ASFVG
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ACD
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00190基因、MGF
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110
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9L基因、ASFVG
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ACD
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00210基因、MGF
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360
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9L基因、MGF
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360
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10L基因、MGF
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360
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11L基因、MGF
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505
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1R基因、MGF
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360
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12L基因、MGF
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360
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13L基因、MGF
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360
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14L基因、MGF
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505
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2R基因和MGF
‑
505
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3R基因，获得了一株安全性较好的减毒非洲猪瘟病毒株；肌肉注射高剂量所述减毒非洲猪瘟病毒株(每头猪免疫105HAD
50
)猪仍不发病，且与免疫猪同居猪核酸和抗体均是阴性，说明该毒株肌肉注射不能够致猪发病死亡、无水平传播现象；而且免疫猪后，猪血清里检测不到病毒，安全性良本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.通过在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018中联合缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，其特征在于，所述基因片段包括ASFVG
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ACD
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00190基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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110
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9L基因的全部/部分核苷酸序列、ASFVG
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ACD
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00210基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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9L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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10L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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11L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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505
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1R基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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12L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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13L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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14L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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505
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2R基因的全部/部分核苷酸序列和MGF
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505
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3R基因的全部/部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202096。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缺失的基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第11627
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12499位和第24164
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35631位。3.通过在II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述基因片段包括ASFVG
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ACD
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00190基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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110
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9L基因的全部/部分核苷酸序列、ASFVG
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ACD
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00210基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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9L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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10L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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11L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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505
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1R基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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12L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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13L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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14L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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505
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2R基因的全部/部分核苷酸序列和MGF
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505
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3R基因的全部/部分核苷酸序列；所述II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202096。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述缺失的基因片段为II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018全长序列的第11627
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12499位和第24164
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35631位。5.一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为基因片段缺失的II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018；所述基因片段包括ASFVG
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ACD
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00190基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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110
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9L基因的全部/部分核苷酸序列、ASFVG
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ACD
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00210基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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9L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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10L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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11L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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505
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1R基因的全部/部分核苷酸序列、MGF
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360
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12L基因的全部/部分核苷酸序列、MGF<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，冯涛，李攀，刘华南，石正旺，马昭，申超超，齐晓兰，吴盼雪，张克山，李丹，党文，杨波，王琦，曹丽艳，朱紫祥，田宏，郭建宏，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：