一种基于荧光素酶亚基互补的主蛋白酶抑制剂活性检测系统及在药物筛选中的应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于荧光素酶亚基互补的主蛋白酶抑制剂活性检测系统及在药物筛选中的应用，将含有蛋白酶酶切位点的多肽序列插入到荧光素酶的两个亚基之间。在蛋白酶没有活性的情况下，荧光素酶两个亚基相互作用的完整性得到保护，因此整个结构具有荧光素酶活性，可以催化化学底物发出荧光。在蛋白酶表现出活性的情况下，连接荧光素酶两个亚基之间的蛋白酶酶切位点的多肽序列被蛋白酶切断，亚基相互作用的完整性被破坏，荧光素酶不再具有荧光素酶活性。据此可以评价主蛋白酶在各种化合物影响下的活性，进而推断化合物对主蛋白酶活性的抑制能力。抑制能力。抑制能力。

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光素酶亚基互补的主蛋白酶抑制剂活性检测系统及在药物筛选中的应用


[0001]本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种基于荧光素酶亚基互补的主蛋白酶抑制剂活性检测系统及在药物筛选中的应用。

技术介绍

[0002]蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、三氨酸蛋白酶、阿斯巴蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等。蛋白酶或者蛋白水解酶在正常的的生理状态下，主要参与体内蛋白质的加工和降解。
[0003]在哺乳类，多肽生物活性物质的成熟离不开蛋白酶的水解作用。例如，胰岛素原在一系列水解酶的作用下加工为胰岛素。与老年痴呆有关的人Aβ淀粉样沉淀，是因为病理条件下蛋白水解酶异常作用导致。
[0004]在病毒类，蛋白酶决定病毒的复制传播。例如，SARS
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CoV
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2复制过程中主蛋白酶(Mpro)的活性决定两条超长复制酶多肽(pp1a和pp1ab)的合成加工，进而决定病毒是否能够成功复制。
[0005]在生物体内，有多种蛋白酶作用于不同的靶蛋白。但是，也有同样的蛋白酶作用于不同的靶蛋白。
[0006]蛋白酶抑制剂可以调控蛋白酶活性，因而蛋白酶抑制剂是临床应用中不可缺少的药物。有关蛋白酶抑制剂的开发，在目前的高通量药物筛选过程中，主要是在底物多肽的氨基端和羧基端分别标记不同的生色团，应用荧光共振的原理加以检测。这种方法优点是灵敏度高，但是每个特定的底物肽段都需要标记，对于同一种蛋白酶，有不同的底物时，标记底物肽段就使实验变得繁琐，成本高昂。

技术实现思路
<br/>[0007]本专利技术的主要目的在于提供了一种基于荧光素酶亚基互补的主蛋白酶抑制剂活性检测系统及在药物筛选中的应用，可以用于蛋白酶抑制剂活性的检测，开发蛋白酶抑制剂的高通量筛选，验证作用于特定序列的蛋白酶。
[0008]本专利技术为解决上述技术问题采用以下技术方案：
[0009]一种基于荧光素酶亚基互补的主蛋白酶抑制剂活性检测系统，包括可发荧光的蛋白酶多肽底物，所述蛋白酶多肽底物通过含有主蛋白酶酶切位点的多肽序列插入到荧光素酶的两个亚基之间得到，所述蛋白酶多肽底物编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0010]进一步的，所述多肽序列的N端连接荧光素酶大亚基，C端连接荧光素酶小亚基。
[0011]基于所述检测系统的检测方法，具体包括以下步骤：
[0012]1)蛋白酶多肽底物的表达与纯化；表达质粒直接转染CHO细胞，含有主蛋白酶多肽底物的荧光素酶从细胞培养基中直接浓缩纯化；
[0013]2)含有主蛋白酶多肽底物的荧光素酶活性的滴定；将步骤1)纯化的含有主蛋白酶
多肽底物的荧光素酶按不同的浓度稀释到384孔板中，加入底物检测荧光素酶的活性；用于确定具体实验时所用的稀释浓度；
[0014]3)将纯化的含主蛋白酶多肽底物的荧光素酶按照步骤2)确定的浓度稀释，加入10μL到384孔板中，加入主蛋白酶；37℃孵育1.5小时，再加入荧光底物检测荧光素酶的活性。
[0015]进一步的，步骤1)所述蛋白酶多肽底物包含分泌肽，荧光素酶小亚基，蛋白酶靶肽，荧光素酶大亚基。
[0016]进一步的，所述荧光素酶大亚基为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第60
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132位所示的蛋白质。
[0017]进一步的，所述荧光素酶小亚基为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第26
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36位所示的蛋白质。
[0018]进一步的，所述分泌肽为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第1
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23位所示的多肽。
[0019]进一步的，所述蛋白酶靶肽为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第43
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53位所示的多肽。
[0020]所述检测系统在药物筛选中的应用。
[0021]所述检测系统在新冠病毒主蛋白酶Mpro抑制剂高通量筛选中的应用。
[0022]有益效果
[0023]1、本专利技术利用荧光素酶亚基互补原理，在多肽底物的氨基端和羧基端分别接入荧光素大小亚基，得到可发荧光的蛋白酶底物。利用该底物检测蛋白酶抑制剂活性具有灵敏，快捷，信号强和成本可控的优点。
[0024]2、人的蛋白水解酶约有500多种，其底物更是复杂繁多。若用化学FRET的方法去做，每个酶切底物都必须用生色团标记，在实际应用中是不可行的。本专利技术检测方法简单，经济，有一定的普遍适应性。大多数小实验室都可以进行类似操作，完成小批量的蛋白酶抑制剂活性分析。
[0025]3、本专利技术可以微量化，用作高通量筛选。微量化后，所用试剂的量进一步减少，大大降低实验成本。
附图说明
[0026]图1为酶学互补方法检测蛋白酶抑制剂活性的原理图(图1A)与蛋白酶多肽底物具体氨基酸序列结构示意图(图1B)。
[0027]图2为含主蛋白酶多肽底物的荧光素酶活性的滴定的结果图。
[0028]图3为不同浓度的M
pro
酶切NanoLuci/M
pro
底物的结果图。
[0029]图4为发现新冠病毒主蛋白酶M
pro
抑制剂的高通量筛选过程示意图。
具体实施方式
[0030]下面详细描述本专利技术的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能解释为对本专利技术的限制。
[0031]本专利技术为解决上述技术问题采用以下技术方案：
[0032]将含有蛋白酶酶切位点的多肽序列插入到荧光素酶的两个亚基之间。蛋白酶酶切位点为TSAVLQ∧SGFRK；在蛋白酶没有活性的情况下，荧光素酶两个亚基相互作用的完整性
得到保护，因此整个结构具有荧光素酶活性，可以催化化学底物发出荧光。在蛋白酶表现出活性的情况下，连接荧光素酶两个亚基之间的蛋白酶酶切位点的多肽序列被蛋白酶切断，亚基相互作用的完整性被破坏，荧光素酶不再具有荧光素酶活性。具体如图1A所示。据此可以评价主蛋白酶在各种化合物影响下的活性，进而推断化合物对主蛋白酶活性的抑制能力。
[0033]实施例1蛋白酶多肽底物的表达与纯化。
[0034]蛋白酶多肽底物的设计如图1B所示。分别包含分泌肽，小亚基，蛋白酶靶肽，大亚基。表达质粒直接转染CHO细胞，含有主蛋白酶多肽底物的荧光素酶可从细胞培养基中直接浓缩纯化。蛋白质的纯化简单易行。所述蛋白酶多肽底物编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。所述荧光素酶大亚基为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第60
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132位所示的蛋白质。所述荧光素酶小亚基为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第26
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36位所示的蛋白质。所述分泌肽为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第1
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23位所示的多肽。所述蛋白酶靶肽为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第43
‑
53位所示的多肽。
[0035]实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光素酶亚基互补的主蛋白酶抑制剂活性检测系统，其特征在于，包括可发荧光的蛋白酶多肽底物，所述蛋白酶多肽底物通过含有主蛋白酶酶切位点的多肽序列插入到荧光素酶的两个亚基之间得到，所述蛋白酶多肽底物编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述一种基于荧光素酶亚基互补的主蛋白酶抑制剂活性检测系统，其特征在于，所述多肽序列的N端连接荧光素酶小亚基，C端连接荧光素酶大亚基。3.根据权利要求1
‑
2任一所述检测系统的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)蛋白酶多肽底物的表达与纯化；表达质粒直接转染CHO细胞，含有主蛋白酶多肽底物的荧光素酶从细胞培养基中直接浓缩纯化；2)含有主蛋白酶多肽底物的荧光素酶活性的滴定；将步骤1)纯化的含有主蛋白酶多肽底物的荧光素酶按不同的浓度稀释到384孔板中，加入底物检测荧光素酶的活性；用于确定具体实验时所用的稀释浓度；3)将步骤1)纯化后的含主蛋白酶多肽底物的荧光素酶按照步骤2)确定的浓度稀释，加入10μL到384孔板中，加入1个单位主蛋白酶；37℃孵育1.5小时，再加入荧光底物检测荧光素酶的活性。4.根据权利要求3所述一种利用荧光素酶亚基互补检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建喜，张志恒，刘霞，孟庆余，高永静，张翼德，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：