杭白菊PCR鉴定试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种杭白菊PCR鉴定试剂盒及应用，所述试剂盒中的特异性引物为HBJ893

【技术实现步骤摘要】
杭白菊PCR鉴定试剂盒及应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种DNA分子鉴定方法，特别涉及中药杭白菊PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。
(二)
技术介绍

[0002]菊花为菊科菊属植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序，道地产地为浙江桐乡、河南焦作、安徽滁州、安徽亳州、安徽歙县等。药菊的品种包括杭白菊、怀菊、滁菊、亳菊、贡菊。菊花含挥发油、菊甙、腺嘌呤、胆碱、氨基酸、黄酮类、酚酸类及刺槐素等活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、降血压、散风清热、平肝明目等功效，可用于治疗风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花等病症。不同的药菊品种，其有效成分和药效差别较大。由于药菊品种较多，来源多样，外观形态类似，单靠外形和传统中药检测方法较难区别，需建立一种新型的鉴定方法。
[0003]本专利技术提供的PCR检测法是一种杭白菊的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定杭白菊。利用PCR检测法对杭白菊进行鉴定尚未见报道。该方法的建立对实现中药现代化，规范管理药菊的种植，采摘和销售，具有重要意义。
(三)
技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种能够准确鉴定中药杭白菊的PCR鉴定试剂盒和检测方法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤，解决了中药杭白菊较难区别的问题。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]本专利技术提供一种杭白菊PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为HBJ893
‑
1和HBJ893
‑
2：
[0007]HBJ893
‑
1:5
’‑
ACTACACGAAGAATGAGTAGGCAGC
‑3’
(SEQ ID NO.2)；
[0008]HBJ893
‑
2:5
’‑
GAACTACGAAACTAACCCGACACG
‑3’
(SEQ ID NO.3)。
[0009]进一步，所述的杭白菊PCR鉴定试剂盒的组成为：
[0010][0011][0012]本专利技术还涉及一种所述杭白菊PCR鉴定试剂盒在杭白菊鉴定中的应用，所述应用的方法为：
[0013](1)模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取样品DNA作为PCR模板；以电泳法检测模板DNA的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模
板DNA；
[0014](2)PCR鉴定：利用杭白菊PCR鉴定试剂盒中的特异性引物HBJ893
‑
1和HBJ893
‑
2进行PCR扩增：
[0015]PCR反应溶液：
[0016][0017]将PCR反应溶液放入PCR扩增仪中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：93℃预变性3min，93℃变性1min，58～62℃复性1min，72℃延伸2min，40个循环，最后72℃延伸10min；
[0018](3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物(即扩增反应后的反应液)10μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在893bp处出现扩增条带为杭白菊，在893bp处不出现扩增条带不是杭白菊。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：(1)本专利技术根据凝胶电泳在893bp处有无扩增条带作为鉴定杭白菊的依据，可以检测单个或者混合杭白菊DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；(2)利用杭白菊PCR鉴定试剂盒中引物HBJ893
‑
1和HBJ893
‑
2以及PCR反应溶液配方可以制造杭白菊鉴定试剂盒；(3)本专利技术提供了一种快速、准确鉴定杭白菊的方法，可以广泛应用于杭白菊中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
(四)附图说明
[0020]图1为12种供试品经PCR检测法鉴定后的电泳图，M
‑
DNA分子量Marker；1
‑
杭白菊(浙江桐乡)；2
‑
怀菊(河南焦作)；3
‑
滁菊(安徽滁州)；4
‑
亳菊(安徽亳州)；5
‑
野菊；6
‑
蒲公英；7
‑
浙白术；8
‑
安白术；9
‑
浙白芍；10
‑
安白芍；11
‑
山白芍；12
‑
川白芍。
[0021]图2为不同浓度的杭白菊经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道M为Marker，泳道1的杭白菊浓度为40ng/μL，泳道2的杭白菊浓度为24ng/μL，泳道3的杭白菊浓度为8ng/μL，泳道4的杭白菊浓度为4ng/μL，泳道5的杭白菊浓度为0.8ng/μL，泳道6的杭白菊浓度为0.4ng/μL。
(五)具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：
[0023]本专利技术所用原料均按照《中国药典》2015版采集制备。
[0024]实施例1
[0025]1、杭白菊PCR检测法关键试剂PCR引物的获得
[0026]应用植物DNA快速提取试剂盒(上海生工生物有限公司)从杭白菊(浙江桐乡)、怀菊(河南焦作)、滁菊(安徽滁州)和亳菊(安徽亳州)中分别提取基因组DNA。使用5000条随机引物，利用RAPD扩增法对四种药菊进行RAPD分析，筛选获得一条杭白菊特异性扩增条带，这条特异性扩增条带只出现在杭白菊品种中，在其他药菊品种中没有，此条带中的DNA分子即是杭白菊特异性DNA分子标记。将杭白菊特异性DNA分子标记从琼脂糖凝胶中回收、克隆、测序，测序结果见SEQ ID NO.1所示，命名为HBJ893。
[0027]根据HBJ893序列，设计一对特异性引物HBJ893
‑
1和HBJ893
‑
2，引物序列为：
[0028]HBJ893
‑
1:5
’‑
ACTACACGAAGAATGAGTAGGCAGC
‑3’
；
[0029]HBJ893
‑
2:5
’‑
GAACTACGAAACTAACCCGACACG
‑3’
。
[0030]上下游引物选取的位点分别对应于HBJ893序列位点上的1
‑
25bp和870
‑
893bp处。
[0031]SEQ ID NO.1为：
[0032]ACTACACGAAGAATGAGTAGGCAGCAGGCTGCACTGGAAAGAATGATGGCCTCACCATA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杭白菊PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物为HBJ893
‑
1和HBJ893
‑
2：HBJ893
‑
1:5
’‑
ACTACACGAAGAATGAGTAGGCAGC
‑3’
；HBJ893
‑
2:5
’‑
GAACTACGAAACTAACCCGACACG
‑3’
。2.如权利要求1所述杭白菊PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述的杭白菊PCR鉴定试剂盒的组成为：3.一种利用权利要求1所述杭白菊PCR鉴定试剂盒在杭白菊鉴定中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏，韩笑杰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：