基于实时荧光PCR技术检测中药金银花白绢病的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了实时荧光PCR技术检测中药金银花白绢病的试剂盒，本发明专利技术的试剂盒的靶基因选自内转录间隔区ITS基因，相比于真菌其他基因在核糖体rDNA整体结构功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有较高的可变性，种间差异显著，能够准确对金银花白绢病病原菌定量检测，提早预防白绢病的发生，为金银花白绢病的防治奠定病原学基础，对保证金银花质量及产量稳定增长具有重要的意义。稳定增长具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
基于实时荧光PCR技术检测中药金银花白绢病的试剂盒


[0001]本专利技术涉及基于实时荧光PCR技术检测中药金银花白绢病的试剂盒，属于病原菌核酸检测


技术介绍

[0002]白绢病，又叫白霉病，此病主要危害植物靠近地面的茎基部和根部。茎基部染病，出现暗褐色、湿润状、不定形的病斑，稍凹陷，潮湿时根部长出辐射状白色绢丝状菌丝体。后期病斑横向扩展，可围绕整个茎基部，致使叶片由下向上逐渐变黄，发病严重的整株脱落枯死。后期菌丝会逐渐向下延伸至根部，引起根腐病，而根部感染后，皮层褐色腐烂，枯死根茎仅剩下纤维组织，易从土中拔出。白绢病的寄生范围较广，侵害包括中草药、农作物、花卉和农林等100多科210多种植物。另外，白绢病病原菌是一种根部习居菌，病原为齐整小核菌 (Selerotium rolfsii Sacc)，有性态为Athelia rolfsii。菌丝在土壤、病株残体、杂草上越冬。病原菌可在土壤中随地表水流进行传播，菌丝依靠生长在土中蔓延，侵染苗木根部或根茎。
[0003]金银花(Lonicera japonica Thunb.)又名忍冬，隶属忍冬科、忍冬属，俗称二宝花、双花、银花等。金银花在《本草纲目》中即有记载，也被收录在《中华人民共和国药典》中，是国家确定的70种名贵药材之一，以其干燥的花蕾或带初开的花入药，研究证实金银花具有很强的清热解毒、抑菌、抗病毒等作用，被誉为光谱型抗生素。很多中成药以金银花为主要配方，是常用大宗药材。山东是金银花道地产区，是众多药企的药源基地，金银花人工种植面积不断扩大，病害发生水平也逐年增高，在对山东金银花病害调查中发现危害金银花的白绢病主要是根基部发病，后期产生白色绢丝膜，造成整株的叶片脱落死亡。该病害可影响金银花生长及产量和品质，造成一定的经济损失。
[0004]金银花作为我国重要传统中药材，目前未见对金银花的白绢病分子检测的相关研究报道，目前对于病害的研究也主要是通过传统的方法，对病原菌培养分离，电镜观察，通过形态学鉴定。寻找快速准确的检测技术可为早期综合防治金银花白绢病提供有效的技术支撑。随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。近年来实时荧光PCR 技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能，因此，本专利技术在目前研究报道的基础上，建立一种快速鉴定金银花白绢病病原荧光定量试剂盒和检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术克服了上述现有技术的不足，提供基于实时荧光PCR技术检测中药金银花白绢病的试剂盒，本专利技术的试剂盒的靶基因选自内转录间隔区ITS基因，能够准确对金银花白绢病病原菌定量检测，提早预防白绢病的发生。
[0006]基于实时荧光PCR技术检测中药金银花白绢病的试剂盒，包含如下引物：
[0007]Athelia_rolfsii
‑
F：ATATAATATATACCCCTGTGAACCAA(SEQ ID NO.1)；
[0008]Athelia_rolfsii
‑
R：AGAACCCAAAAAATCCGTG(SEQ ID NO.2)。
[0009]进一步的，上述试剂盒中还包括金银花白绢病病原菌的实时荧光PCR检测用的探针、实时荧光PCR反应扩增体系和金银花白绢病病原菌的阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
[0010]进一步的，上述探针的核苷酸序列如下所示：
[0011]Athelia_rolfsii P：5'FAM
‑
TGTATGTTACATAGAACGATTTCATATTGA
‑
BHQ2 3'(SEQ IDNO.3)。
[0012]进一步的，所述探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团；其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1，BHQ2 中的任一种。本专利技术的优选方案为5'端使用荧光基团FAM标记，3'末端使用淬灭基团BHQ1 标记。
[0013]进一步的，上述荧光PCR反应扩增体系如下：
[0014]试剂名称工作浓度用量(μl)终浓度TaqMan Master Mix2
×
101
×
引物组5
‑
10μM10.25
‑
0.5μM探针组合物1
‑
5μM10.05
‑
0.25μMDNA模板1
‑
50ng/μL22
‑
100ng双蒸水 6 总体积 20 [0015]进一步的，上述阳性对照品为金银花白绢病病原菌的基因组DNA。
[0016]进一步的，上述阴性对照品为金银花白绢病病原菌以外的菌株的基因组DNA。
[0017]进一步的，上述空白对照品为无菌水。
[0018]进一步的，利用上述试剂盒检测金银花白绢病的方法，包括如下步骤：
[0019]1)从待测样品中提取DNA为模板，选择内转录间隔区ITS基因为靶基因；
[0020]2)利用上述试剂盒进行PCR扩增；
[0021]3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是否检出。
[0022]进一步的，上述步骤2)中所述的PCR扩增的程序为：95℃10min，预变性；95℃10s， 60～63℃35s(在此收集荧光信号)，40个循环。
[0023]进一步的，上述步骤3)中所述的根据探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是否检出指：待测基因出现扩增曲线，且Ct值＜35，则判断为阳性，如果36＜Ct≤40，判断为可疑，可加大模板量重复实验，如果有扩增曲线判定为阳性，否则为阴性，无扩增曲线或Ct≥40，判定为阴性。
[0024]有益效果：
[0025]本专利技术靶基因选自内转录间隔区ITS基因，相比于真菌其他基因在核糖体rDNA整体结构功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有较高的可变性，种间差异显著，故利用ITS 序列作为白绢病病原菌靶基因具有特性强，准确性高。
[0026]本专利技术设计白绢病病原菌特异性引物、特异性探针双重特异性大大提高了准确性
和可靠性。荧光定量PCR是在同一管内检测，无需开盖，不易污染，具有准确稳定、操作简单，灵敏度高，特异性强，通量大等有益效果，能快速准确的鉴定金银花病害标本及土壤等样本材料。利用本专利技术，可无需经过病原菌的分离、培养，可以对真菌基因组DNA或田间样本DNA 进行PCR扩增，且通过荧光定量PCR技术可以对样本中的白绢病病原菌进行定量检测，准确的预测白绢病的发生时期，流行强度，提早防治甚至避免白绢病的发生，可以降低因使用农药带来的负面影响，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于实时荧光PCR技术检测中药金银花白绢病的试剂盒，其特征在于，包含如下引物：Athelia_rolfsii
‑
F：ATATAATATATACCCCTGTGAACCAA；Athelia_rolfsii
‑
R：AGAACCCAAAAAATCCGTG。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括金银花白绢病病原菌的实时荧光PCR检测用的探针、实时荧光PCR反应扩增体系和金银花白绢病病原菌的阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如下所示：Athelia_rolfsii P：5'FAM
‑
TGTATGTTACATAGAACGATTTCATATTGA
‑
BHQ2 3'。4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团；其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应扩增体系如下：试剂名称工作浓度用量/μl终浓度TaqMan Master Mix2
×
101
×
引物组5
‑
10μM10.25
‑
0.5μM探...

【专利技术属性】
技术研发人员：张全芳，陈雪燕，胡悦，刘国霞，范阳阳，刘艳艳，谭晴晴，杨雪，姚川，步迅，
申请(专利权)人：山东省农业科学院，
类型：发明
国别省市：