检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物、探针及其应用制造技术

本发明专利技术属于农业技术领域，具体涉及一种检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物、探针及其应用。本发明专利技术的检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物和探针，其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术选取尖孢镰刀菌黄瓜专化型的基因组中HPEG序列中一段保守序列，针对该序列设计得到特异性引物和探针，设计得到的特异性引物和探针可以扩增出片段单一的目的片段，而在其他细菌中均没有扩增信号，从而本发明专利技术利用所述引物及探针能够实现对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的特异性检测。黄瓜专化型的特异性检测。黄瓜专化型的特异性检测。

【技术实现步骤摘要】
检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物、探针及其应用


[0001]本专利技术属于农业
，具体涉及一种检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物、探针及其应用。

技术介绍

[0002]黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)引起的黄瓜系统性土传病害，在世界各地普遍发生，对黄瓜的品质和产量造成严重的损失。由于土传病害受气候等外界环境因子的影响相对较小，土壤中病原菌数量往往是病害流行的主要决定因素。因此构建可特异性检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物及探针，定量检测土壤中病原菌数量对此类病害预测预报及有效防治具有重要意义。
[0003]目前检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的方法主要包括传统方法和分子生物学方法。其中，传统方法主要包括显微镜观察法和利用柯赫氏法则进行回接试验，传统方法的弊端在于用时较长工作量较大。分子生物学的方法包括利用ITS1和ITS4的引物进行普通PCR，这种方法需结合系统发育树分析，只能鉴定到种，无法鉴定到专化型，且准确性较差。此外，一些研究报道利用特异性引物通过普通PCR的方法来鉴定尖孢镰刀菌黄瓜专化型，然而，此方法无法对所鉴定的病原菌进行定量分析。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物、探针。
[0005]本专利技术的再一目的在于提供上述引物、探针的应用。
[0006]本专利技术的再一目的在于提供上述引物、探针在检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型方面的应用。
[0007]本专利技术的再一目的在于提供定量检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的方法。
[0008]根据本专利技术具体实施方式的检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物和探针，所述引物的核苷酸序列如下：
[0009]SEQ ID NO.1：5＇
‑
GATGGTACAACAACTGCAAGGA
‑
3＇，
[0010]SEQ ID NO.2：5＇
‑
CCAACAAACAGAGCAAAACTAA
‑
3＇；
[0011]所述探针的核苷酸序列如下：
[0012]SEQ ID NO.3：5＇
‑
AGCACGTAGAACCGCCGTCCTT
‑
3＇。
[0013]根据本专利技术具体实施方式的检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物和探针，所述探针的5
’
端标记荧光基团，所述探针的3
’
端标记淬灭基团，其中，荧光基团可选FAM、HEX、TET等，淬灭基团可选TAMRA、BHQ(BHQ1、BHQ2)、MGB等。
[0014]本专利技术还提供检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物和探针的应用，尤其是在制备检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的试剂盒方面，或者，在进行检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的方面，上述应用均使用到本专利技术的特异性引物、探针。
[0015]根据本专利技术具体实施方式的检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的方法，所述方法包括使
用上述引物和探针对待测样品进行PCR扩增的步骤。
[0016]其中，PCR扩增体系包括rTaq酶0.5μL，Mg
2+
3μL，10
×
Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，引物及探针各1.0μL，DNA模板5μL，BSA 5μL，ddH2O 4μL。
[0017]PCR扩增程序为95℃预变性1min；95℃变性30s、60℃退火45s(此处收集信号)，共48个循环。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术选取尖孢镰刀菌黄瓜专化型的基因组HPEG序列中的一段保守序列，针对该序列设计得到特异性引物和探针，设计得到的特异性引物和探针可以扩增出片段单一的目的片段，而在其他细菌中均没有扩增信号，从而本专利技术利用所述引物及探针能够实现对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的特异性检测。
[0020]本专利技术可以检测1拷贝的样本DNA，在重组质粒1
×
100～1
×
106拷贝数范围内线性关系良好，实现了尖孢镰刀菌黄瓜专化型的特异性定量检测，可以准确预测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的数量。同时，本专利技术利用上述引物和探针定期监测土壤中尖孢镰刀菌黄瓜专化型的含量，为黄瓜枯萎病的发生提供预测预报的作用。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1显示尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性检测结果，其中，a为Foc F1和Foc R1引物进行PCR扩增所得到的电泳片段；M：marker DL1000；1.尖孢镰刀菌西瓜专化型；2.尖孢镰刀菌草莓专化型；3
‑
7.尖孢镰刀菌萎蔫专化型；8.尖孢镰刀菌冬瓜专化型；9.尖孢镰刀菌黄瓜专化型；10
‑
11.尖孢镰刀菌甜瓜专化型；12.尖孢镰刀菌烟草专化型；13.尖孢镰刀菌辣椒专化型；14.尖孢镰刀菌向日葵专化型；15.禾谷镰刀菌；16.假禾谷镰刀菌；17.立枯丝核菌；18.大丽轮枝菌；19.黄色镰刀菌；20.三线镰刀菌；21
‑
22.层出镰刀菌；23.木贼镰刀菌；24.胶孢镰刀菌；25.茄镰孢菌；26.腐皮镰刀菌；27.柔毛镰刀菌；28.锐顶镰刀菌；29.离蠕孢菌；30.平脐蠕孢菌；31
‑
39.尖孢镰刀菌番茄专化型；40.弯孢菌；41.黑斑病菌；42.黑白轮枝菌；43.灰霉菌；
[0023]b为Foc F2和Foc R2引物进行PCR扩增所得到的电泳片段；M：marker DL1000；1.尖孢镰刀菌西瓜专化型；2.尖孢镰刀菌草莓专化型；3
‑
7.尖孢镰刀菌萎蔫专化型；8.尖孢镰刀菌冬瓜专化型；9
‑
10.尖孢镰刀菌黄瓜专化型；11.尖孢镰刀菌甜瓜专化型；12.尖孢镰刀菌烟草专化型；13.尖孢镰刀菌辣椒专化型；14.尖孢镰刀菌向日葵专化型；15.禾谷镰刀菌；16.假禾谷镰刀菌；17.立枯丝核菌；18.大丽轮枝菌；19.黄色镰刀菌；20.三线镰刀菌；21.层出镰刀菌；22.木贼镰刀菌；23.胶孢镰刀菌；24.茄镰孢菌；25.腐皮镰刀菌；26.柔毛镰刀菌；27.锐顶镰刀菌；28.离蠕孢菌；29.平脐蠕孢菌；30
‑
42.尖孢镰刀菌番茄专化型；43.弯孢菌；44.黑白轮枝菌；45.灰霉菌；
[0024]c为Foc F3和Foc R3引物进行PCR扩增所得到的电泳片段；M：marker DL1000；1.尖孢镰刀菌西瓜专化型；2.尖孢镰刀菌草莓专化型；3
‑
7.尖孢镰刀菌萎蔫专化型；8.尖孢镰刀
菌冬瓜专化型；9
‑
10.尖孢镰刀菌黄瓜专化型；11.尖孢镰刀菌甜瓜专化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：SEQ ID NO.1：5＇
‑
GATGGTACAACAACTGCAAGGA
‑
3＇，SEQ ID NO.2：5＇
‑
CCAACAAACAGAGCAAAACTAA
‑
3＇；所述探针的核苷酸序列如下：SEQ ID NO.3：5＇
‑
AGCACGTAGAACCGCCGTCCTT
‑
3＇。2.根据权利要求1所述的检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物和探针，其特征在于，所述探针的5
’
端标记荧光基团，所述探针的3
’
端标记淬灭基团。3.根据权利要求1或2所述的检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型的引物和探针，其特征在于，所述探针的5
’
端标记有FAM荧光染料，所述探针的...

【专利技术属性】
技术研发人员：董丽红，马平，郭庆港，李社增，王培培，鹿秀云，赵卫松，张晓云，苏振贺，
申请(专利权)人：河北省农林科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：