一种淫羊藿的DNA条形码、引物对及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种淫羊藿的DNA条形码、引物对及其应用，本发明专利技术所提供的箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示，所述引物对序列：ITS2序列扩增正向引物：ITS2F:5'

【技术实现步骤摘要】
一种淫羊藿的DNA条形码、引物对及其应用


[0001]本专利技术属于中药材DNA分子鉴定及应用的
，更具体地，涉及对中药材箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”核糖体上一条基因ITS2和叶绿体上的一条基因psbA
‑
trnH进行PCR扩增并测序，利用两条基因扩增的序列建立“黔藿1号”的条形码。同时，筛选SRAP引物对，建立“黔藿1号”区别于淫羊藿属其他物种的特异性条带。

技术介绍

[0002]中药材淫羊藿Epimediifolium是小檗科淫羊藿属植物淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.etZucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥叶，是我国传统大宗药材，其性温、味辛、甘，归肝、肾经，具补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，临床上主要用于肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛等症。
[0003]“黔藿1号”为贵州省非主要农作物和食用菌品种认定专家委员会中药材专业委员会于2021年认定通过的中药材箭叶淫羊藿优良品种，其品质优（叶片总黄酮醇苷含量达到14.8%，是目前发现的淫羊藿属植物中总黄酮醇苷含量最高的一个种）、产量高（以根段茎繁育的种苗在种植2年后田间产量可达到鲜叶360kg/亩），主要种植于贵州省黔东南、黔南一带。
[0004]小檗科淫羊藿属下有41个物种，被历版《中国药典》收载作为中药材淫羊藿的物种仅有淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿和朝鲜淫羊藿4个，巫山淫羊藿被《中国药典》单独收载。淫羊藿属植物野生资源丰富，在我国分布较广，加之淫羊藿属于我国传统大宗药材且下游开发的产品较多，对淫羊藿药材的需求量大，过去主要靠采挖野生资源为主，导致野生资源濒临灭绝状态，同时，因野生资源杂乱，质量参差不齐，导致下游产品质量不稳定，最终疗效不稳定也是必然。随着我国中医药事业的发展，中医药必将走出国门，对中药材质量的要求不断提高，药材基源可追溯，种苗繁育、种植、采收、加工、包装等环节规范化的文件、政策相应出台并实施。“黔藿1号”属于人工选育出的具备特异性、稳定性和一致性的箭叶淫羊藿优良品种，在加工端如何保证所需原料即为“黔藿1号”仍需要一个可操作、易于实施的技术手段。
[0005]为保证中药材箭叶淫羊藿质量稳定、临床疗效可靠，需建立一种可明确箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”基源的定性鉴别和定量鉴定相结合的方法，以保护“黔藿1号”的真实性。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码、引物对及其应用。
[0007]本专利技术所提供的箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码，包含ITS2序列：Composition104A;130C;137G;114T;0OTHER
Percentage:21.4%A;26.8%C;28.2%G;23.5%T;0.0%OTHERMolecularWeight(kDa):ssDNA:149.85dsDNA:299.03SEQIDNO.1:GAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCATTAGGTCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCACAGCGTCGCTCCCACCATGATGCCTTTGTTCTGTTATCGGGCAACTGCAACGTGGCTTGGGAAGCGGATATTGGCCCCCCGTACCTTTGTAGGCGCGGCCGGCCTAAAATTCGGCCCTCGGCGACGAGCGTCACGATCAGTGGTGGTTSEQIDNO.2:GAATAACCCCTTTGTCATAGACCGGTATCGTGTTGTTTCGTCGTCTATTTGGGCCATATGGACCCTTGCGTGTCGTATAAACGACATTCACTCTGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAGAAGAAACTTACAAGGATTCCCTTAGTAACGGCGAGCGAACCGGGATCAGCCCAGCTTGGGAATCGGGCGACTTCGTTGTCCGAATTGTAGTC。
[0008]以及psbA
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trnH序列：Composition155A;83C;95G;205T;0OTHERPercentage:28.8%A;15.4%C;17.7%G;38.1%T;0.0%OTHERMolecularWeight(kDa):ssDNA:166.08dsDNA:331.59SEQIDNO.3:AGGACATTCCCCGCAGTCAGCTGCTGTTGAGGCTCCATCTACAAATGGCTAAGACGTAGGTCTTTTTCTATTCAAGTAATTGAATAATTGAATTTTTATAATAGCGACCCACCCTCCCGCCCTTGTAAAGATGTTGGGACGTTCTTGTGCATTGGATATTTTTTGATTTTTTGCTTCATACTCATTTTTTTGTTTTTTTGCTTTTAGTAGAAAAAGCATTACTATATCAACAGGACTCCTTCATTATTACCCTATTGTCCTATTGCTTCASEQIDNO.4:TATCTTTTGTTTCTTTGGATTTTTTGATCTTTTTATCGTGTTAGTTCGCTAGTTCGCTTTTTCGTATTGTTGTCTAGTGATTAAATGGTTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAAAAAGCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAAGAAATACTAAAGTACAAAGGTAGAGTGGAAAATTGATTCTTTCGTTCTTTTAAGTTAAGAAATTAAAAGAGCAAAGGGACCCAAGTGGACAAAGGGATTGGAGTGGGGATCACCCCATGC。
[0009]一种定量鉴别箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”的DNA条形码的PCR引物对，其特征在于：所述引物序列： ITS2序列扩增正向引物：ITS2F:5'
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ATGCGATACTTGGTGTGAAT
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3'，反向引物ITS2R:5'
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GACGCTTCTCCAGACTACAAT
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3'。
[0010]psbA
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trnH序列扩增正向引物：psbAF:5'
‑
GTTATGCATGAACGTAATGCTC
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3'；反向引物trnHR:5'
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CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
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3'一种定量鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法，包括以下步骤：（1）从待测样品中提取DNA；（2）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用PCR引物进行ITS2的扩增；以无本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码，其特征在于：包含ITS2序列：如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2 所示；以及psbA
‑
trnH序列：如SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示。2.一种箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码的PCR引物对，其特征在于：所述引物序列： ITS2序列扩增正向引物：ITS2F: 5'
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ATGCGATACTTGGTGTGAAT
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3'，反向引物ITS2R: 5'
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GACGCTTCTCCAGACTACAAT
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3'；psbA
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trnH序列扩增正向引物：psbAF: 5'
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GTTATGCATGAACGTAATGCTC
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3'；反向引物trnHR: 5'
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CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
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3' 。3.权利要求1所述的箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码或者权利要求2所述的PCR引物对在鉴别箭叶淫羊藿“黔藿1号”物种中的应用。4.一种如权利要求1所述的箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码或者如权利要求2所述的PCR引物对的用途，其特征在于：用于鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”这个品种。5.一种鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的箭叶淫羊藿“黔藿1号”的DNA条形码的PCR引物对。6.一种定量鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）从待测样品中提取DNA；（2）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用PCR引物进行ITS2的扩增；以无菌水为PCR空白对照，以箭叶淫羊藿“黔藿1号”基因组DNA为PCR阳性对照，所述PCR引物：ITS2序列扩增正向引物：ITS2F: 5'
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ATGCGATACTTGGTGTGAAT
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3'，反向引物ITS2R: 5'
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GACGCTTCTCCAGACTACAAT
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3'；（3）取步骤（2）扩增出的核苷酸片段用琼脂糖凝胶电泳分离，置于凝胶成像系统中观察，当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带则说明PCR结果可靠；（4）以ITS2的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，进而获得待测样品DNA的ITS2序列；设置以加去离子水代替加模板DNA的PCR反应为阴性对照；（5）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用PCR引物进行psbA
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trnH的扩增；以无菌水为PCR空白对照，以箭叶淫羊藿“黔藿1号”基因组DNA为PCR阳性对照，所述PCR引物：psbA
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trnH序列扩增正向引物：psbAF: 5'
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GTTATGCATGAACGTAATGCTC
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3'；反向引物trnHR: 5'
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CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
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3'；（6）以psbA
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trnH的PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，进而获得待测样品DNA的psbA
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trnH序列；设置以加去离子水代替加模板DNA的PCR反应为阴性对照；若获得的序列与SEQ ID NO.1 至SEQ ID NO.4中的相似度≥99%，则为“黔藿1号”这个物种，若低于这个值则为其他物种。7.如权利要求6所述的定量鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法，其特征在于：包括以下步骤进行：(a)将小檗科淫羊藿属植株的幼嫩组织用75%乙醇擦拭表面，然后用灭菌后的超纯水冲洗，用无菌纸擦拭干净，放入液氮速冻，使用研钵粉碎成细粉，然后采用DNA提取试剂盒Plant DNA Kit (D3485)进行DNA的分离和纯化，提取过程严格按照试剂盒使用说明书提取
基因组DNA；进一步地，吸取步骤(a)中的DNA样品溶液2
ꢀµ
L，以Elution Buffer作为空白溶液，用NANO DROP1000分光光度计检测DNA样品溶液的浓度及纯度，纯度要求在1.8~2.0范围，浓度及纯度判定合格进入下一步操作程序；(b)进一步地，配制含2
ꢀµ
L TS
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GelRed核酸凝胶染料Ver.2的1%琼脂糖凝胶，具备配制步骤为：称取凝胶用琼脂粉0.30 g，置于含35 mL去离子水的体积为250 mL的三角瓶中，将三角瓶置于微波炉中，加热溶解琼脂，取出，待琼脂液温度在60 ℃时，使用移液器加入2
ꢀµ
L TS
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GelRed核酸凝胶染料Ver.2，混匀后立即倒入制胶模子，待完全凝固后，加入步骤(a)中的DNA样品溶液4
ꢀµ
L，loading Buffer 1
µ
L，在含0.5
×
TBE缓冲液的水平电泳仪中，90 V电压下电泳时间30 min，电泳结束后取出琼脂糖凝胶，在凝胶成像系统下拍照，检测DNA质量，合格的DNA样品表现为：在凝胶中为一明亮条带，条带前后无明显白色斑点；DNA质量判定合格进入下一步操作程序； (c)进一步地，配制步骤(a)中DNA样品液ITS2的PCR扩增体系25
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L，其中ITS2正向引物（序列为：ITS2F: 5'
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ATGCGATACTTGGTGTGAAT
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3'）溶液1
ꢀµ
L，ITS2反向引物（序列为：ITS2R: 5'
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【专利技术属性】
技术研发人员：汪永平，刘红昌，
申请(专利权)人：贵州贵基生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：