新型异丙基苹果酸合酶变异体及使用其生产L-亮氨酸的方法技术

本公开涉及具有异丙基苹果酸合酶活性的新型修饰多肽、编码该多肽的多核苷酸、包含该多肽的微生物和通过培养该微生物生产L

【技术实现步骤摘要】
新型异丙基苹果酸合酶变异体及使用其生产L
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亮氨酸的方法
[0001]分案信息
[0002]本申请是2017年10月20日递交的申请号为201780001521.0、专利技术名称为“新型异丙基苹果酸合酶变异体及使用其生产L
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亮氨酸的方法”的专利技术专利申请的分案申请。


[0003]本公开涉及具有异丙基苹果酸合酶活性的新型修饰多肽、编码该多肽的多核苷酸、包含该多肽的微生物和通过培养该微生物生产L
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亮氨酸的方法。

技术介绍

[0004]L
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亮氨酸(L
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Leucine)是一种必需氨基酸，其价格昂贵并广泛用于药物、食品、饲料添加剂、工业化学品等。此外，主要使用微生物来生产L
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亮氨酸。包括L
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亮氨酸在内的支链氨基酸的发酵主要通过埃希氏杆菌属的微生物(a microorganism of the genus Escherichia)或棒状杆菌属的微生物(a microorganism of the genus Corynebacterium)经过若干步骤来进行，已知的是由丙酮酸(pyruvic acid)来生物合成2
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酮异己酸(2
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ketoisocaproate)而作为前体(precursor)(韩国专利号10
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0220018和10
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0438146)。
[0005]作为参与亮氨酸生物合成的酶，异丙基苹果酸合酶(Isopropylmalate synthase，以下称为“IPMS”)是亮氨酸生物合成中第一步骤的酶，其将缬氨酸生物合成途径中产生的2
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酮异戊酸(2
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ketoisovalerate)转化为异丙基苹果酸，使得亮氨酸代替缬氨酸进行生物合成，因此IPMS是亮氨酸生物合成过程中重要的酶。然而，IPMS受到最终产物L
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亮氨酸或其衍生物的反馈抑制。因此，尽管存在与释放反馈抑制而生产高浓度亮氨酸的IPMS变异体相关的各种现有技术(美国专利公开申请号2005
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0079641和美国专利号6403342)，但仍在继续研究以发现更好的变异体。
[0006]在这些情况下，本专利技术人尝试开发一种可用于以高浓度生产L
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亮氨酸的IPMS变异体，并由此开发出了一种新型IPMS变异体。据证实，该变异体释放出由L
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亮氨酸(为最终产物)引起的反馈抑制并增强了其活性，使得该变异体能够通过含有其的微生物以高产率生产L
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亮氨酸，从而实现本公开。

技术实现思路

[0007]技术问题
[0008]本公开的一个目的是提供具有异丙基苹果酸合酶活性的新型修饰多肽。
[0009]本公开的另一个目的是提供编码所述修饰多肽的多核苷酸。
[0010]本公开的又一个目的是提供含有所述多肽的生产L
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亮氨酸的棒状杆菌(Corynebacterium)属的微生物。
[0011]本公开的又一个目的是提供通过在培养基中培养所述微生物来生产L
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亮氨酸的方法。
[0012]技术方案
[0013]为了实现上述目的，本公开的一方面提供了具有异丙基苹果酸合酶活性的新型修饰多肽。该新型修饰多肽可以是如下具有异丙基苹果酸合酶活性的修饰多肽：其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的多肽的N端的558位的精氨酸被非精氨酸的氨基酸残基置换，或者由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的多肽的N端的561位的甘氨酸被非甘氨酸的氨基酸残基置换。本公开的修饰多肽不仅比具有异丙基苹果酸合酶活性的多肽SEQ ID NO：1具有更高的活性，而且还具有释放L
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亮氨酸反馈抑制的特征。
[0014]如本文所用，术语“异丙基苹果酸合酶”是指通过与乙酰辅酶A(acetyl
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CoA)反应来将2
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酮异戊酸转化成异丙基苹果酸(L
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亮氨酸的前体)的酶。可以包括本公开的异丙基苹果酸合酶，只要该酶具有转化活性即可，而不论微生物的来源。具体地，异丙基苹果酸合酶可以是源自棒状杆菌(Corynebacterium)属的微生物的酶。更具体地，异丙基苹果酸合酶可以是源自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的异丙基苹果酸合酶，具体地，可以包括氨基酸序列SEQ ID NO：1，但不限于此。此外，异丙基苹果酸合酶可以包括与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的多肽。例如，显而易见的是，具有这种同源性并表现出对应于异丙基苹果酸合酶效果的氨基酸序列可以包括在本公开的范围之内，即使其氨基酸序列中的某些序列缺失、被修饰、被置换或被添加。
[0015]如本文所用，术语“异丙基苹果酸合酶活性的增加”是指异丙基苹果酸转化活性的增加。因此，与具有异丙基苹果酸合酶活性的多肽SEQ ID NO：1相比，本公开的修饰多肽具有更高水平的异丙基苹果酸转化活性。异丙基苹果酸转化活性可以通过测量产生的异丙基苹果酸水平而被直接证实，或者可以通过测量所产生的辅酶A(CoA)的水平来间接证实。如本文所用，术语“活性的增加”可与“增强的活性”结合使用。此外，异丙基苹果酸是L
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亮氨酸的前体，因此与具有异丙基苹果酸合酶活性的多肽SEQ ID NO：1相比，使用本公开的修饰多肽产生了更高水平的L
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亮氨酸。
[0016]此外，与具有异丙基苹果酸合酶活性的多肽SEQ ID NO：1不同，本公开的修饰多肽的特征在于释放了作为最终产物的L
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亮氨酸或其衍生物的反馈抑制。如本文所用，术语“反馈抑制”是指在酶体系中，最终产物在酶体系的早期状态下的反应抑制。对于本公开的目的，反馈抑制可以是L
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亮氨酸或其衍生物抑制异丙基苹果酸合酶(其介导生物合成途径的第一步骤)活性的反馈抑制，但不限于此。因此，当释放出对异丙基苹果酸合酶的反馈抑制时，与不释放反馈抑制的情况相比，可以增加L
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亮氨酸的生产率。
[0017]如本文所用，术语“修饰”、“修饰的”或“变异体”是指在一种稳定表型中显示出遗传性或非遗传性交替的培养物或个体。具体地，术语“变异体”可以意指：与野生型相比，由于与源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的异丙基苹果酸合酶对应的氨基酸序列被修饰而有效增加其活性的变异体；释放L
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亮氨酸或其衍生物的反馈抑制的变异体；或释放反馈抑制和增加活性二者的变异体。
[0018]具体地，具有异丙基苹果酸合酶活性的本公开的修饰多肽可以是如下具有异丙基苹果酸合酶活性的修饰多肽：其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的多肽的N端的55本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产L
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亮氨酸的属于棒状杆菌属的修饰微生物，其包含具有异丙基苹果酸合酶活性的修饰多肽，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的多肽的N端的561位的甘氨酸被所述修饰多肽中的天冬氨酸置换，并且其中所述修饰微生物具有对正亮氨酸或L
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亮氨酸的抗性。2.根据权利要求1所述的修饰微生物，其中编码所述修饰多肽的多核苷酸的天然启动子被与所述天然启动子相比增强所述多核苷酸的表达的启动子置换。3.根据权利要求2所述的修饰微生物，其中与所述天然启动子相比增强所述多核苷酸的表达的所述启动子是PCJ7启动子。4.根据权利要求1所述的修饰微生物，其中属于棒状杆菌属的所述修饰微生物源自谷氨酸棒状杆菌。5.一种生产L
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亮氨酸的棒状杆菌属的微生物，其由载体转化，所述载体包含：i)编码具有异丙基苹果酸合酶活性的修饰多肽的多核苷酸；和ii...

【专利技术属性】
技术研发人员：李智惠，宋秉哲，全爱智，金宗贤，金蕙园，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：