一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种高效生产(2S,3S)

【技术实现步骤摘要】
一种高效生产(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效生产(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]2,3
‑
丁二醇是分子式为(CH3CHOH)2的有机化合物，在常温下是一种无色无味的液体或者晶体。2,3
‑
丁二醇拥有两个手性碳原子，因此它有三种立体异构体，分别是meso
‑
2,3
‑
丁二醇、(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇和(2R,3R)
‑
2,3
‑
丁二醇。并且2,3
‑
丁二醇的三种立体异构体由于存在不同的手性基团而各自拥有不同的性质，这一特性使得光学纯2,3
‑
丁二醇在不对称合成中备受关注。
[0003]2,3
‑
丁二醇在航空燃料，医药，食品，化妆品等多个方面具有广泛的应用。具有光学活性的2,3
‑
丁二醇在不对称合成有价值的手性化合物方面具有很好的应用前景。(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇可用于药物阿司匹林的关键中间体
‑‑
对甲苯磺酸酯，其低凝固点(
‑
60℃)的特性，使其可作为抗冻剂，并且它也是合成手性试剂和配体的重要前体物质。(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇还可用于电镀业中用作光亮剂，聚氨酯橡胶与纤维生产中的扩连剂，也用作溶剂和增湿剂，在制增塑剂、医药、聚酯树脂、聚氨基甲酸树脂等方面也具有广泛的应用。
[0004]现阶段生产单一构型2,3
‑
丁二醇主要有生物法和化学合成方法。化学合成2,3
‑
丁二醇的立体异构体选择性生产工艺复杂，控制困难，实施成本高。此外，通过化学路线生产的2,3
‑
丁二醇的光学纯度相当低。所以生物技术路线已成为手性2,3
‑
丁二醇的首选方法，但是大多数天然微生物发酵会产生两种不同构型的2,3
‑
丁二醇并且天然微生物产生的2,3
‑
丁二醇中(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇的占比通常较小，例如，克雷伯氏菌和肠杆菌属的菌株主要产(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇和meso
‑
2,3
‑
丁二醇，芽孢杆菌属主要生产(2R,3R)
‑
2,3
‑
丁二醇和meso
‑
2,3
‑
丁二醇，至今未发现产单一构型2,3
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丁二醇的天然微生物。这是由于双乙酰的生成是由α
‑
乙酰乳酸自发氧化脱羧产生，并且双乙酰浓度过高会对微生物正常生长代谢产生影响，因此在正常条件下双乙酰很难积累到较高的浓度，进而只能产生少量的(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇。
[0005]全细胞作为一种在有机合成中被广泛应用的生物催化剂，常应用于需要辅因子再生的合成反应比如还原酶催化的反应，只需在反应液中加入廉价的葡萄糖，就可达到细胞内部辅因子再生。此外，全细胞催化法产物分离较简单，具有工业化应用前景。并且，在单一构型(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇的生产中，菌株发酵时由于双乙酰对菌体生长代谢的抑制，菌株只能在非常低的双乙酰浓度下进行发酵，而在全细胞催化反应时细胞可以在较高浓度的双乙酰中进行反应。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种高效生产(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇的基因工
程菌及其构建方法与应用。本专利技术将肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶在大肠杆菌中表达，构建以双乙酰为底物的(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇代谢途径，从而实现以双乙酰为底物转化生产(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种高效生产(2S,3S)
‑
2,3
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丁二醇的基因工程菌，所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶，或者同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶，或者同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶。
[0009]根据本专利技术优选的，所述基因工程菌为重组的大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
[0010]根据本专利技术优选的，所述2,3
‑
丁二醇脱氢酶为来自肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌的2,3
‑
丁二醇脱氢酶，其编码基因分别为KbudC，GbudC，LbudC，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。
[0011]根据本专利技术优选的，所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因LbudC位于pET28a质粒，KbudC位于pETDuet
‑
1质粒；所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因LbudC位于pET28a质粒，GbudC位于pETDuet
‑
1质粒；所述基因工程菌同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因KbudC位于pET28a质粒，GbudC位于pETDuet
‑
1质粒。
[0012]上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0013](1)将肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶基因KbudC，GbudC，LbudC分别插入pET28a，构建表达载体质粒pET28a
‑
KbudC，pET28a
‑
GbudC和pET28a
‑
LbudC；
[0014](2)将肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
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丁二醇脱氢酶基因KbudC和GbudC分别插入pETDuet
‑
1质粒，构建表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效生产(2S,3S)
‑
2,3
‑
丁二醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶，或者同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶，或者同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为重组的大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述2,3
‑
丁二醇脱氢酶为来自肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌的2,3
‑
丁二醇脱氢酶，其编码基因分别为KbudC，GbudC，LbudC，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3
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丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因LbudC位于pET28a质粒，KbudC位于pETDuet
‑
1质粒；所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因LbudC位于pET28a质粒，GbudC位于pETDuet
‑
1质粒；所述基因工程菌同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
‑
丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因KbudC位于pET28a质粒，GbudC位于pETDuet
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1质粒。5.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌中的2,3
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丁二醇脱氢酶基因KbudC，GbudC，LbudC分别插入pET28a，构建表达载体质粒pET28a
‑
KbudC，pET28a
‑
GbudC和pET28a
‑
LbudC；(2)将肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3
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丁二醇脱氢酶基因KbudC和GbudC分别插入pETDuet
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1质粒，构建表达载体质粒pETDuet
‑
KbudC和pETDuet
‑
GbudC；(3)将表达载体pET28a
‑
KbudC、pET28a
‑
GbudC、pET28a
‑
LbudC转化进大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑选阳性重组子，得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
LbudC；(4)将表达载体pETDuet
‑
KbudC转化进重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
LbudC，将表达载体pETDuet
‑
GbudC分别转化进重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
LbudC和重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
KbudC，挑选阳性重组子，得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a
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LbudC/pETDuet
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KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a
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KbudC/pETDuet
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GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a
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LbudC/pETDuet
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GbudC。6.如权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到2,3
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丁二醇脱氢酶基因KbudC序列，PCR引物序列如下：Primer1:5
′‑
ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAAAAAGTCGCACTTGTTACC
‑3′
(含EcoRI酶切位点)，Primer2:5
′‑
GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTAGTTAAATACCATCCCGCCG
‑3′
(含SacI酶切位点)；PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃55sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
将载体质粒pET28a，pETDuet
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：马春玲，邵明宇，王瑞明，李丕武，苏静，汪俊卿，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：