使用重叠非等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断剂寡核苷酸进行等位基因特异性扩增制造技术

本发明专利技术提供包含阻断剂和第一引物寡核苷酸的寡核苷酸组合物。所述阻断剂寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻断剂可变子序列的第一序列。非靶特异子序列在其3

【技术实现步骤摘要】
使用重叠非等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断剂寡核苷酸进行等位基因特异性扩增
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求19.05.14提交的美国临时专利申请第62/000,114号的优先权，其通过引用全文纳入本文。
[0003]序列表
[0004]序列表仅以电子形式与本申请一同提交，其通过引用纳入本文。序列表文本文件"14
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21013
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WO(260947.00251)_SL.txt"创建于2015年5月18日，大小为13,144字节。

技术介绍

[0005]DNA和RNA中的微小差异可导致包括人类在内的生物体的总体身体健康和健康状态的巨大差异。例如，细菌基因组中的单碱基改变可导致抗生素抗性，以及人类基因组中的一个单碱基改变可导致癌症进展。随着基因组学领域的成熟和随之而来的许多核酸生物标志物序列和分子的发现，存在来自生物技术工业的发展可区分单碱基改变的可靠、稳健、廉价和精确的核酸试验的强烈需求。具体地，已开发等位基因特异性的许多基于PCR的试验。
[0006]用于选择性检测稀有突变的基于PCR的方法可大体分类为两类方法：(A)等位基因特异性引物，和(B)利用等位基因特异性阻断剂的非等位基因特异性引物。
[0007]等位基因特异性引物的示例包括扩增阻碍突变系统(ARMS)、等位基因特异性阻断剂PCR(ASB
‑
PCR)、和竞争性等位基因特异性TaqMan PCR(castPCR)。(B)的示例包括PNA阻断剂PCR和低变性温度共扩增PCR(COLD
‑
PCR)。
[0008]本专利技术之前，等位基因特异性引物通常在检测已知单碱基突变时具有优势(更高的突变敏感性)，而非等位基因特异性引物与等位基因特异性阻断剂通常用于检测多重紧密簇集的突变(热点)或未知突变序列。
[0009]等位基因特异性PCR引物例如ARMS、ASB
‑
PCR、castPCR通常在引物的最3
’
端具有等位基因特异性核苷酸。等位基因特异性PCR引物使用DNA聚合酶的识别力来特异延伸合适配对的碱基，但是受到下述限制：当发生不正确的DNA聚合酶延伸事件时，作为引物一部分的稀有等位基因核苷酸被纳入模板，随后扩增循环变得不再特异。等位基因特异性PCR引物仅在第一不正确扩增事件之前具有特异性。用非等位基因特异性引物进行等位基因特异性检测需要精确的变性温度控制以及对更小序列的受限分析。用非等位基因特异性引物进行等位基因特异性检测的突变敏感性低并且更易于受到聚合酶导入错误的影响。
[0010]因此，需要具有等位基因扩增特异性更高和突变敏感性改善的非等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断剂寡核苷酸的组合物。因此，开发适合检测大量变体中少量靶标的新方法是诊断应用的前提条件。因此，本专利技术提供非等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断剂寡核苷酸的组合物，从而提供用于疾病诊断应用例如癌症诊断等的更精确且高效的工具。

技术实现思路

[0011]本专利技术涉及重叠非等位基因特异性引物寡核苷酸和等位基因特异性阻断剂寡核苷酸的组合物，用于等位基因特异性扩增。
[0012]本专利技术提供包含阻断剂和第一引物寡核苷酸的寡核苷酸组合物。所述阻断剂寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻断剂可变子序列的第一序列。然而，在一些示例中，若待测靶核酸用于检测插入时，阻断剂寡核苷酸可不包含阻断剂可变子序列。阻断剂可变子序列在其3
’
和5
’
端被所述靶中性子序列侧接，并且与该靶中性子序列连续。所述第一引物寡核苷酸足以诱导酶促延伸；本文中，第一引物寡核苷酸包含第二序列。所述第二序列与该靶中性子序列的5
’
端重叠至少5个核苷酸；从而所述第二序列包含重叠子序列和非重叠子序列。第二序列不包含与阻断剂可变子序列同源的任何序列。
[0013]本专利技术还涉及扩增靶序列的方法。所述方法包括获取样品，所述样品含一或多拷贝的第一核酸和至少一拷贝的第二核酸，所述第一核酸含变体序列；所述第二核酸含所述靶序列。靶序列和变体序列各自包含同源子序列和可变子序列。所述可变子序列还含至少一个核苷酸。所述靶序列的可变子序列是靶特异性子序列并且所述变体序列的可变子序列是非靶特异性子序列。
[0014]获取样品后，将阻断剂寡核苷酸引入样品。所述阻断剂寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻断剂可变子序列的第一序列。所述靶中性子序列与所述同源子序列的部分互补并且所述阻断剂可变子序列与所述非靶特异性子序列互补。此外，阻断剂可变子序列在其3
’
和5
’
端被所述靶中性子序列侧接，并且与该靶中性子序列连续。
[0015]之后，将第一引物寡核苷酸引入所述样品。所述第一引物寡核苷酸足以诱导酶促延伸。第一引物寡核苷酸包含第二序列，所述第二序列与所述同源子序列的第二部分互补。此外，所述第二序列与该靶中性子序列的5
’
端重叠至少5个核苷酸；从而所述第二序列包含重叠子序列和非重叠子序列。所述第二序列不包含任何与所述可变子序列互补的序列。
[0016]下一步，向所述样品引入DNA聚合酶、三磷酸核苷、和基于聚合酶的核酸扩增所需的一种或多种试剂；和在足以实现核酸扩增的条件下使样品反应。
[0017]本专利技术的一个优势是改善的突变敏感性，其匹配和/或超过等位基因特异性引物方案。
[0018]本专利技术的另一优势是具有显著温度(8℃)稳健性的简单的2步热循环方案。
[0019]本专利技术的另一优势是提供便宜的DNA引物和阻断剂试剂而无需复杂的骨架或核苷酸修饰。
[0020]本专利技术的另一优势是与高保真酶相容。
[0021]本专利技术的另一优势是等位基因特异性阻断剂与变体的结合比与靶标的结合更强，从而相比结合至变体的阻断剂，非等位基因特异性引物更有利于替代结合至靶标的阻断剂。使用非等位基因特异性引物的优势是伪扩增的变体导致扩增产物(扩增子)承载变体序列而不是靶序列。因此，每个循环都产生(compound)特异性。
[0022]此概况以简化形式提供本专利技术的引导描述、某些方面、优势和新特性，后续详细描述中进一步阐明。本概述并不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。
[0023]附图的简要说明
[0024]当结合附图进行阅读时，将更好地理解前面的
技术实现思路
以及下面的示例性实施方式的详细说明。为了图示本专利技术，附图中显示本专利技术的示例性构建。然而，本专利技术并不局限于本文所述的具体方法和手段。
[0025]图1显示用于本专利技术所述等位基因特异性扩增的非等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断剂的示意图。
[0026]图2显示本专利技术所述引物和阻断剂的热动力学设计的示意图。
[0027]图3显示根据本专利技术序列的ΔG
°
值计算的示意图。图3以出现顺序分别公开了SEQ ID NO 1,33,1,34,本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寡核苷酸组合物，包含：(a)阻断剂寡核苷酸，其在3
’
端或3
’
端附近包含功能基团或非互补序列区域，其阻止酶促延伸，所述阻断剂寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻断剂可变子序列的第一序列，所述靶中性子序列具有第一部分和第二部分，所述阻断剂可变子序列在其3
’
端侧接所述靶中性子序列的第一部分、在其5
’
端侧接所述靶中性子序列的第二部分并与靶中性子序列的第一和第二部分连续；和(b)第一引物寡核苷酸，其足以诱导酶促延伸，所述第一引物寡核苷酸包含第二序列，所述第二序列与所述靶中性子序列重叠至少5个核苷酸，从而所述第二序列包含重叠子序列和非重叠子序列，并且其中所述第二序列不包含所述阻断剂可变子序列，其中，所述第一引物寡核苷酸的第二序列产生对靶序列的杂交标准自由能ΔG
°
PT
，所述阻断剂寡核苷酸的第一序列产生对靶序列的杂交标准自由能ΔG
°
BT
，并满足下述条件：+2kcal/mol≥ΔG
°
PT
‑
ΔG
°
BT
≥
‑
8kcal/mol；并且其中，所述第一引物寡核苷酸的非重叠子序列产生对靶序列的杂交标准自由能ΔG
°3，并满足下述条件：
‑
4kcal/mol≥ΔG
°3≥
‑
12kcal/mol。2.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物，其中，所述功能基团包含3
‑
碳间隔子或双脱氧核苷酸。3.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物，其中，所述重叠子序列包含靶中性子序列的5
’
端的部分，其中所述部分为约5个核苷酸至约40个核苷酸。4.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物，其中，所述重叠子序列包含靶中性子序列的5
’
端的部分，其中所述部分为约7个核苷酸至约30个核苷酸。5.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物，其中，所述阻断剂寡核苷酸的浓度比所述第一引物寡核苷酸的浓度高约2至约10,000倍。6.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物，其中，所述阻断剂寡核苷酸的浓度比所述第一引物寡核苷酸的浓度高约5至约1,000倍。7.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物，还包含第二引物寡核苷酸，所述第二引物寡核苷酸足以诱导酶促延伸，所述第二引物寡核苷酸包含第三序列，所述第三序列不与所述第一序列或第二序列重叠，并且，所述第三序列是靶中性的并且足以用来与所述第一引物寡核苷酸通过聚合酶链式反应来扩增核酸区域。8.如权利要求7所述的寡核苷酸组合物，还包含第二阻断剂寡核苷酸，所述第二阻断剂寡核苷酸在3
’
端或3
’
端附近包含第二功能基团或第二非互补序列区域，其阻止酶促延伸，其中，所述第二阻断剂寡核苷酸包含具有第二靶中性子序列和第二阻断剂可变子序列的第四序列，其中，所述第二阻断剂可变子序列是所述阻断剂可变子序列的互补序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：威廉马歇莱思大学，
类型：发明
国别省市：