DNA水凝胶、制备方法、水凝胶组合物及其应用技术

本发明专利技术公开了DNA水凝胶、制备方法、水凝胶组合物及其应用，其中DNA水凝胶，至少由RCA产物一、RCA产物二共混后形成，所述RCA产物一、RCA产物二共混的体积比为1：(1

【技术实现步骤摘要】
DNA水凝胶、制备方法、水凝胶组合物及其应用


[0001]本专利技术是关于生物免疫技术，尤其是T细胞的分离与培养等方面的技术，特别是关于一种应用于T细胞分离的DNA水凝胶、制备方法、水凝胶组合物及其应用。

技术介绍

[0002]免疫细胞可通过直接杀伤肿瘤细胞或触发适应性免疫反应来抑制肿瘤的进展，其中肿瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞与肿瘤的进展密切相关。因此，高效分离高纯度、低损伤的肿瘤浸润淋巴细胞对于研究其在免疫治疗方面的应用具有重要意义，同时具有很高的挑战。目前，在肿瘤浸润淋巴细胞的分离技术中主要有密度梯度离心、免疫磁珠富集法和荧光激活细胞分选技术等。密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离，从而达到细胞分离的目的。免疫磁珠富集法是通过在磁珠表面修饰抗体后，在外加磁场的作用下洗脱进行细胞分离。荧光激活细胞分选技术是使用靶细胞特异性荧光染料将待分离细胞群染色后进行流式细胞术分选，从而将表面荧光染色靶细胞和未被染色的非靶细胞分离开。这些分离技术虽有着较高的分离效率，但在分离过程中细胞易受机械力和引入的标记物影响，进而损伤或污染细胞，分离的细胞纯度也不高。同时，分离的细胞若用于培养和进一步的治疗应用，将需要额外的系统和佐剂。
[0003]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种DNA水凝胶、制备方法、水凝胶组合物及其应用，通过将DNA适配体的反义序列设计到了滚环扩增的环状DNA模板上，成功的得到了含有多个DNA适配体的DNA长链，提高了对T细胞的选择性，提高了分离T细胞的效率和分离质量。
[0005]肿瘤组织消化的细胞混合液细胞组分更复杂，含有多种类型的细胞，提高了DNA水凝胶靶向及分离T细胞的难度。
[0006]说明，在本专利技术中，技术术语某一组分终浓度是指该组分所在的体系完成最终配制时所体现的浓度，比如RCA产物一中NaCl的终浓度，即为RCA产物一完成品中NaCl的浓度。
[0007]为实现上述目的，本专利技术的实施例提供了DNA水凝胶，至少由RCA产物一、RCA产物二共混后形成，RCA产物一、RCA产物二共混的体积比为1：(1
‑
5)，其中，RCA产物一其组成至少包括，以每100微升计：(5
×
10
‑3～1
×
10
‑2)nmol的环状DNA模板一、(3～5)U的phi 29 DNA聚合酶、终浓度为1
×
phi 29 DNA聚合酶缓冲液、终浓度为(0.1～0.4)微克/微升的BSA、(0.05～0.1)nmol的dNTPs、终浓度(60～80)mmol/L的NaCl；RCA产物二其组成至少包括，以每100微升计：(5
×
10
‑3～1
×
10
‑2)nmol的环状DNA模板二，(3～5)U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度为1
×
phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度为0.2微克/微升的BSA，(0.05～0.1)nmol的dNTPs，终浓度(60～80)mmol/L的NaCl。
[0008]本专利技术的“1
×”
表示1倍量，是以市售产品按照说明进行补齐稀释后获得，下同。
[0009]在本专利技术的一个或多个实施方式中，环状DNA模板一为由具有末端缺口的环状DNA
‑
1与T4DNA连接酶反应获得，环状DNA
‑
1为经5
’
端磷酸化修饰的ssDNA
‑
1和引物1反应获得，ssDNA
‑
1的碱基数为92～158，引物1的碱基数为16～37，并且ssDNA
‑
1的5
’
端和3
’
端分别与引物1的3
’
端和5
’
端互补配对。本专利技术方案针对T细胞的选择性捕获与培养，特别是从组织粉碎液中进行选择，对ssDNA以及引物的选择提出较高的要求，而ssDNA
‑
1具有更长的功能性序列，二级结构较为复杂，所以模板的合成难度提升，需要筛选合适长度的引物进行材料合成及后续细胞分离，选择难度大。
[0010]在本专利技术的一个或多个实施方式中，环状DNA模板二为由具有末端缺口的环状DNA
‑
2与T4DNA连接酶反应获得，环状DNA
‑
2为经5
’
端磷酸化修饰的ssDNA
‑
2和引物2反应获得，ssDNA
‑
2的碱基数为92～158，引物2的碱基数为16～37，ssDNA
‑
2的5
’
端和3
’
端分别与引物2的3
’
端和5
’
端互补配对。
[0011]在本专利技术的一个或多个实施方式中，DNA水凝胶的制备方法，包括如下步骤：准备环状DNA模板一和环状DNA模板二；制备RCA产物一：依据比例如前述的组成配制并以无菌水补齐至100微升后，于350～500rpm转速下,30～37℃震荡4～16h得到；制备RCA产物二：依据比例如前述的组成配制并以无菌水补齐至100微升后，于350～450rpm转速下,30～37℃震荡4～16h得到。
[0012]在本专利技术的一个或多个实施方式中，环状DNA模板一的制备为：依比例，100ng的环状DNA
‑
1中加入1U的T4DNA连接酶，在1
×
T4buffer中，16～252℃下反应6～24h，得到。
[0013]在本专利技术的一个或多个实施方式中，环状DNA
‑
1的制备为：ssDNA
‑
1和引物1按照摩尔比为1：(1
‑
1.5)的比例混合，加入终浓度60～80mmol/L的NaCl，无菌水补齐至20微升，依据程序加热退火获得。需要注意的是ssDNA
‑
1和引物1的摩尔比视结合效率而定，可以在应用中适当提高引物的用量。
[0014]在本专利技术的一个或多个实施方式中，环状DNA模板二的制备为：依比例，100ng的环状DNA
‑
2中加入1U的T4DNA连接酶，在1
×
T4buffer中，16～25℃下反应6～24h，得到。
[0015]在本专利技术的一个或多个实施方式中，环状DNA
‑
2的制备为：ssDNA
‑
2和引物2按照摩尔比为1:(1
‑
1.5)的比例混合，加入终浓度60～80mmol/L的NaCl，无菌水补齐至20微升，依据程序加热退火获得。需要注意的是ssDNA
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA水凝胶，用于T细胞分离，其特征在于，至少由RCA产物一、RCA产物二共混后形成，所述RCA产物一、RCA产物二共混的体积比为1：(1
‑
5)，其中，所述RCA产物一其组成至少包括，以每100微升计：(5
×
10
‑3～1
×
10
‑2)nmol的环状DNA模板一、(3～5)U的phi 29 DNA聚合酶、终浓度为1
×
phi 29 DNA聚合酶缓冲液、终浓度为(0.1～0.4)微克/微升的BSA、(0.05～0.1)nmol的dNTPs、终浓度(60～80)mmol/L的NaCl；所述RCA产物二其组成至少包括，以每100微升计：(5
×
10
‑3～1
×
10
‑2)nmol的环状DNA模板二，(3～5)U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度为1
×
phi29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度为(0.1～0.4)微克/微升的BSA，(0.05～0.1)nmol的dNTPs，终浓度(60～80)mmol/L的NaCl。2.如权利要求1所述的DNA水凝胶，其特征在于，所述环状DNA模板一为由具有末端缺口的环状DNA
‑
1与T4 DNA连接酶反应获得，所述环状DNA
‑
1为经5
’
端磷酸化修饰的ssDNA
‑
1和引物1反应获得，所述ssDNA
‑
1的碱基数为92～158，所述引物1的碱基数为16～37，并且所述ssDNA
‑
1的5
’
端和3
’
端分别与引物1的3
’
端和5
’
端互补配对。3.如权利要求1所述的DNA水凝胶，其特征在于，所述环状DNA模板二为由具有末端缺口的环状DNA
‑
2与T4 DNA连接酶反应获得，所述环状DNA
‑
2为经5
’
端磷酸化修饰的ssDNA
‑
2和引物2反应获得，所述ssDNA
‑
2的碱基数为92～158，所述引物2的碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：仰大勇，姚池，贾雪梅，
申请(专利权)人：天津大学浙江研究院，
类型：发明
国别省市：