一种“Y型”多功能DNA纳米组装体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种“Y型”多功能DNA纳米组装体、制备方法及其应用，该多功能DNA纳米组装体由四条DNA杂交形成“Y型”结构，包括链ab，链cb*，链d，以及链e；且链d与链ab的部分序列互补，链e与链cb*的部分序列互补，链ab和链cb*上均修饰有细胞膜锚定基团，链d上带有邻硝基苄基光切割基团。制备方法包括步骤：S1.合成ab序列；S2.合成cb*序列；S3.合成d序列；S4.合成序e序列；S5.将四条DNA序列混合加热退火杂交。该多功能DNA纳米组装体能快速地锚定在细胞膜表面，实现对细胞膜表面的c

【技术实现步骤摘要】
一种“Y型”多功能DNA纳米组装体、制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]细胞的多种蛋白共同构筑成复杂的信号网络参与各种细胞活动，在维持细胞正常生理活动以及疾病的发生发展过程中都起到重要的作用。这个信号网络中的蛋白都不是孤立地存在，它们的功能与表达水平受到精确的调控，其中某种蛋白功能变化所引发的信号级联反应影响着其他蛋白的功能和表达，实现对细胞行为的精准调控。在细胞间质上皮转化因子(c
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Met)介导的细胞信号转导过程中，c
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Met受体能够感知并整合外界环境的刺激信号，其配体肝细胞生长因子(HGF)与c
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Met受体结合诱导受体二聚通常被认为是c
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Met信号转导过程的第一步。激活的c
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Met受体将信号传递到细胞内，通过选择性地激活或抑制特定信号分子，从而促进细胞的增殖、迁移、侵袭和血管新生等多种细胞行为。例如，c
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Met信号通路激活后能够提高血管内皮生长因子(VEGF)的分泌水平，从而促进血管新生过程。由于c
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Met信号通路在生理功能和疾病进展中的重要作用，通过按需调节c
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Met受体功能实现细胞功能调控已经引起了广泛的关注。考虑到相关信号分子之间的密切联系，特定信号分子的变化可以作为评价上游调控效果的反馈。因此，在保持蛋白的结构和状态不受影响前提下，对信号网络中的蛋白进行精准按需调控和实时监测有助于系统地阐明蛋白的生物功能和作用机制，并促进智能治疗药物的开发，对精准医疗的发展具有重要意义。
[0003]目前，免疫印迹和酶联免疫吸附测定等传统策略是广泛应用于验证信号分子变化(表达水平或翻译后修饰等)的检测手段。然而，这些方法在分析之前需要繁琐的实验操作，且无法对活细胞进行实时监测。尽管基于基因编辑策略的荧光生物传感器能够用于细胞信号分子的监测，但向细胞导入新的基因需要复杂耗时的步骤，且仍面临因过表达重组成分而干扰细胞内源信号通路的风险，不利于实际应用。此外，由于缺乏能够实现多任务处理的策略，现有的研究方法无法同时实现蛋白功能调控和实时监控调控结果。
[0004]功能核酸具有突出的可编程性和多样性，在构建多功能纳米组装体方面有突出潜力。其中，核酸适配体作为一种能够结合特定目标分子的功能核酸，已经被设计用于精准探测活细胞中的信号分子。一些核酸适配体被报道可通过阻碍蛋白
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蛋白相互作用来干扰细胞信号通路的激活过程。然而，迄今为止，基于功能核酸的纳米组装体在活细胞蛋白功能调控与监测的多功能应用仍然存在挑战。第一方面，由于核酸适配体本身的尺寸较小，与靶标蛋白结合后容易发生解离，受环境影响较大。第二方面，活细胞的细胞内吞作用也使得单个游离核酸适配体的调控和检测效率仍然不理想，尤其是针对细胞表面的受体和分泌信号蛋白。第三方面，目前所构建的探针通常只包含单一的功能模块，只能执行调控或监测的单一操作，无法满足对细胞信号网络中的多个蛋白实现多功能响应的需求，无法对调控结果进行实时监测。实现为了解决上述技术问题，现在亟需研发出一种稳定、高效的多功能DNA纳米组装体来实现蛋白功能的精准调控及信号转导关键分子的实时监测。

技术实现思路
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[0005]本专利技术目的是提供了一种“Y型”多功能DNA纳米组装体、制备方法及其应用，要解决的技术问题包括但不限于以下任一技术问题：第一方面，如何构建具备多任务处理能力的DNA纳米组装体，第二方面，如何实现可控、高效调控c
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Met受体蛋白功能以及信号转导过程；第三方面，如何实现实时监测对c
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Met受体蛋白功能的调控效果。为实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体，由四条DNA杂交形成“Y型”结构，具体包括序列如SEQ ID NO.1所示的链ab，序列如SEQ ID NO.2所示的链cb*，序列如SEQ ID NO.3所示的链d，以及序列如SEQ ID NO.4所示的链e；且所述链d与所述链ab的部分序列互补，所述链e与所述链cb*的部分序列互补，所述链ab和所述链cb*上均修饰有所述细胞膜锚定基团，所述链cb*上带有Cy3荧光基团，所述链d上带有邻硝基苄基光切割基团(Photocleavable linker，PC
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linker)，所述链e上带有BHQ
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2荧光猝灭基团。本方案中，所述杂交形成“Y型”结构的四条DNA组成锚定模块、调控模块和监测模块三个功能模块，所述锚定模块为包含有细胞膜锚定基团修饰的双链DNA，所述调控模块包含有识别c
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Met受体蛋白的核酸适配体和光切割基团修饰的阻挡探针，所述监测模块包括一个识别VEGF蛋白的核酸适配体和阻挡探针。
[0007]在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述链ab包含有靶向识别c
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Met受体蛋白的核酸适配体序列，所述链cb*包含有靶向识别VEGF蛋白的核酸适配体序列。
[0008]在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述链ab上带有Cy5荧光基团，所述链d上带有BHQ
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2荧光猝灭基团
[0009]在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述细胞膜锚定基团为疏水性分子中的一种，所述疏水性分子包括胆固醇分子、生育酚分子和二酰基脂质体。
[0010]在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述四条DNA为人工合成，或任何其他来源的如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的核酸序列。
[0011]本专利技术还提供一种上述的细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体的制备方法，包括以下步骤：
[0012]S1.合成序列如SEQ ID NO.1所示的所述ab序列；
[0013]S2.合成序列如SEQ ID NO.2所示的所述cb*序列；
[0014]S3.合成序列如SEQ ID NO.3所示的所述d序列；
[0015]S4.合成序列如SEQ ID NO.4所示的所述e序列；
[0016]S5.将步骤S1至S4中的四条DNA序列按照摩尔浓度1:1:1:1进行混合，混合后于95℃加热5分钟进行退火相互杂交，缓慢冷却至室温。
[0017]在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，分别将步骤S1至S4中的四条DNA序列配备成浓度为10μM的溶液后再按照比例混合。
[0018]本专利技术还提供一种上述的细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体在核酸适配体抑制剂药物中的应用。
[0019]本专利技术还提供一种上述的细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体在实时监测细胞膜表面受体功能调控效果相关研究中的应用。
[0020]本专利技术还提供本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体，其特征在于，由四条DNA杂交形成“Y型”结构，具体包括序列如SEQ ID NO.1所示的链ab，序列如SEQ ID NO.2所示的链cb*，序列如SEQ ID NO.3所示的链d，以及序列如SEQ ID NO.4所示的链e；且所述链d与所述链ab的部分序列互补，所述链e与所述链cb*的部分序列互补，所述链ab和所述链cb*上均修饰有细胞膜锚定基团，所述链cb*上带有Cy3荧光基团，所述链d上带有邻硝基苄基光切割基团，所述链e上带有BHQ
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2荧光猝灭基团。2.根据权利要求1所述的细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体，其特征在于，所述链ab包含有靶向识别c
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Met受体蛋白的核酸适配体序列，所述链cb*包含有靶向识别VEGF蛋白的核酸适配体序列。3.根据权利要求2所述的细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体，所述链ab上带有Cy5荧光基团，所述链d上带有BHQ
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2荧光猝灭基团。4.根据权利要求3所述的细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体，其特征在于，所述细胞膜锚定基团为疏水性分子中的一种，所述疏水性分子包括胆固醇分子、生育酚分子和二酰基脂质体。5.根据权利要求1
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4任意一项所述的细胞膜锚定的“Y型”多功能DNA纳米组装体，其特征在于，所述四条DNA为人工合成，或任何其他来源的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈珊，李婧影，梁虹，张晨，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：