一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法技术

本发明专利技术涉及一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法，包括发酵基础培养基，发酵补料培养基一和二；发酵基础培养基包括：葡萄糖7.5

【技术实现步骤摘要】
一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法


[0001]本专利技术属于发酵
，具体涉及一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法。

技术介绍

[0002]多杀菌素是刺糖多胞菌有氧发酵的胞内次级代谢产物，属于大环内酯类抗生素，其因高效低残留对哺乳动物、鸟类、鱼类甚至大多数益虫具有宽广的安全界限等优点，而多次获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。
[0003]然而，目前多杀菌素的发酵生产所存在的问题是，传统的发酵方式下，刺糖多胞菌的产素水平低，刺糖多胞菌的生产潜力不能得到有效发挥。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术中的的缺陷，提供了一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案如下：
[0006]技术方案一：
[0007]一种多杀菌素发酵培养基，包括发酵基础培养基，发酵补料培养基一，发酵补料培养基二；
[0008]所述发酵基础培养基中，包括以下原料：葡萄糖7.5
‑
8％，棉籽粉2.5
‑
3％，酵母膏0.5
‑
1％，玉米浆0.5
‑
1％，蛋白胨0.5
‑
1％，磷酸二氢钾0.2
‑
0.4％，碳酸钙0.2
‑
0.3％，硫酸铵0.5
‑
1％，硫酸锰0.0002
‑
0.005％，钼酸钠0.0002
‑
0.0005％，硫酸亚铁0.0001
‑
0.0002，大豆油0.5
‑
1％，消沫剂0.015
‑
0.03％；水余量，PH调至7.2
‑
7.4；
[0009]所述发酵补料培养基一中，包括以下原料：玉米浆30％、磷酸二氢钾2％、氯化钠2％，水余量；
[0010]所述发酵补料培养基二中，包括以下原料：葡萄糖65％，磷酸二氢钾0.5％，水余量。
[0011]进一步的，所述发酵基础培养基的灭菌方法为：121
‑
123℃温度灭菌30min；
[0012]所述发酵补料培养基一的灭菌方法为：121
‑
123℃温度灭菌30min；
[0013]所述发酵补料培养基二的灭菌方法为：115
‑
120℃温度灭菌20
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25min。
[0014]技术方案二：
[0015]一种发酵生产多杀菌素的方法，包括如下步骤：
[0016]首先将灭菌后的发酵基础培养基调节pH为7.0
‑
7.3；然后将种子培养液按10％
‑
15％的接种量接种于发酵基础培养基中，发酵培养250
‑
320h，即可。
[0017]进一步的，发酵培养时，发酵温度为28
‑
30℃。
[0018]进一步的，发酵培养时，发酵液溶氧水平为：菌体处于迟滞期和对数生长期时，控制发酵液溶氧水平大于等于50％；
[0019]菌体进入生产期后，控制发酵液溶氧水平35
‑
50％。
[0020]进一步的，发酵培养时，当菌体进入生产期后，通过补入pH调节剂的方式控制发酵液pH为6.0
‑
7.0。
[0021]进一步的，发酵培养中，当发酵时间达到85
‑
90h和185
‑
190h时，分别补入发酵补料培养基一；所述发酵补料培养基一的补料体积为运行体积的1.5
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2.0％。
[0022]进一步的，发酵培养中，当发酵液残糖水平<2.0％(重量体积比百分含量)时，每24h补入一次发酵补料培养基二，当发酵液运行中生物量有开始下降趋势或者通过补料后残糖消耗速度减慢时，即可停止补料；所述发酵补料培养基二的补料体积＝(2％
‑
当天检测残糖的含量％)*发酵液体积/发酵补料培养基二中葡萄糖的浓度。
[0023]进一步的，所述发酵补料培养基二的补料方式为：一次性加入的补料方式或自动流加的补料方式。
[0024]进一步的，发酵培养过程中，每24小时取样检测发酵液的PH、生物量、残糖、氨基氮；40小时后开始每24h取样检测产物多杀菌素的浓度。
[0025]进一步的，所述种子培养液由活化后的刺糖多胞菌进行种子罐培养获得，所述种子培养液中菌体的生物量大于等于16％，种子培养液PH>7.0，菌体形态为球形。
[0026]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0027]1、发酵液培养过程补料工艺控制：本专利技术的专利技术人研究发现，剌糖多胞菌发酵生产多杀菌素是一个部分生长偶联型发酵，在生长期菌体主要以消耗氮源为主，碳源的消耗速率比较低，因此，为了提高发酵液生物量，本专利技术在基础培养基中加入了酵母膏和玉米浆这两种快速利用的氮源，促进了菌体的生长和生物量的累积，而到了生产期快速利用的氮源减少，菌体生长速率和生物量的维持得不到保证，菌丝体自溶及衰老的速度加快，为此在菌体进入生产期后，本专利技术通过补入含有速效氮源玉米浆的发酵补料培养基，以确保菌体生长所必须的营养物质，
[0028]在本专利技术中还添加有磷酸二氢钾，其是刺糖多胞菌发酵生产多杀菌素不可缺少的物质之一，其既能促进菌体的生长代谢又有利于产物的合成；而且本专利技术在发酵补料培养基中也添加磷酸二氢钾的方式，其目的在于：可以将发酵基础培养基中磷酸二氢钾的用量从传统的超量范围降低到最适范围，避免高浓度的磷酸二氢钾对菌体的生长代谢和产物的合成产生抑制作用，此外，随着培养周期的运行，底物中的浓度不断减少，磷酸二氢钾的促进作用会逐渐减弱，为此在补料中添加了一定的磷酸二氢钾，在确保其促进作用同时还对发酵液的PH值起到一定缓冲作用。
[0029]本专利技术在发酵补料培养基二中加入氯化钠，可以起到维持细胞内外渗透压的作用，确保菌丝体的正常的生长代谢和产物的合成，降低胞内产物的不断积累造成的负面影响；
[0030]2、发酵过程中残糖工艺的控制：
[0031]刺糖多胞菌发酵生产多杀菌素优选葡萄糖做为单一的碳源，但是高浓度的葡萄糖会产生葡萄糖效应，影响菌丝体对碳源的利用，从而影响到菌体的生长和产物合成，为此在基础培养基中只加入了7
‑
8％的葡萄糖，随着菌体的生长代谢和产物的合成，葡萄糖不断被消耗利用，发酵液中残糖会逐渐减少，不能满足菌体正常的生长代谢和产物的合成，因此，本专利技术在发酵液残糖水平<2.0％(重量体积比百分含量)时，需要补充一定量的葡萄糖。
[0032]3、发酵结束时间的控制：发酵液运行当生物量有开始下降趋势，残糖表现通过补料后消耗速度减慢时停止补料，运行后出现PH回升，氨基氮提高，发酵液的效价几乎不再增长时，此时意味发酵结束，本专利技术发酵液运行周期控制在250
‑
320小时。
[0033]综上，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多杀菌素发酵培养基，其特征在于，包括发酵基础培养基，发酵补料培养基一，发酵补料培养基二；所述发酵基础培养基中，包括以下原料：葡萄糖7.5
‑
8％，棉籽粉2.5
‑
3％，酵母膏0.5
‑
1％，玉米浆0.5
‑
1％，蛋白胨0.5
‑
1％，磷酸二氢钾0.2
‑
0.4％，碳酸钙0.2
‑
0.3％，硫酸铵0.5
‑
1％，硫酸锰0.0002
‑
0.0005％，钼酸钠0.0002
‑
0.0005％，硫酸亚铁0.0001
‑
0.0002，大豆油0.5
‑
1％，消沫剂0.015
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0.03％；水余量，PH调至7.2
‑
7.4；所述发酵补料培养基一中，包括以下原料：玉米浆30％、磷酸二氢钾2％、氯化钠2％，水余量；所述发酵补料培养基二中，包括以下原料：葡萄糖65％，磷酸二氢钾0.5％，水余量。2.根据权利要求1所述的一种多杀菌素发酵培养基，其特征在于，所述发酵基础培养基的灭菌方法为：121
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123℃温度灭菌30min；所述发酵补料培养基一的灭菌方法为：121
‑
123℃温度灭菌30min；所述发酵补料培养基二的灭菌方法为：115
‑
120℃温度灭菌20
‑
25min。3.一种利用如权利要求1或2所述发酵培养基发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：首先将灭菌后的发酵基础培养基调节pH为7.0
‑
7.3；然后将种子培养液按10％
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【专利技术属性】
技术研发人员：祁桂玲，程曦，王学伟，范令涛，杨柳，
申请(专利权)人：河北兴柏农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：