一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，包括如下步骤：步骤1、阿佛曼链霉菌的菌种制备：将冷冻保藏的阿佛曼链霉菌菌种接种于茄子瓶斜面培养基上，于28

【技术实现步骤摘要】
一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺


[0001]本专利技术属于发酵生产
，具体涉及一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺。

技术介绍

[0002]生物农药是指利用生物活体(真菌，细菌，昆虫病毒，转基因生物，天敌等)或其代谢产物(信息素，生长素，萘乙酸，2，4
‑
D等)针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。
[0003]而阿维菌素(Avermectins，AVM)，又称阿佛曼菌素，是由阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)发酵产生的一组大环内酯类抗生素。其作为一种光谱杀虫的绿色生物农药，自诞生以来深受人类青睐，得到了广泛的应用。但是在阿维菌素产业发展中，抗药性逐年递增、液态发酵下所产生的废渣、废水以及制造过程中大量有机溶剂的使用，对动植物、土壤、生态环境，带来较大危害等瓶颈问题，成为制约生物农药产业健康发展的一个重要问题。
[0004]而以活体微生物、活性代谢产物为有效成分创制安全高效的生物农药新品种，由于其具有绿色高效、低成本、低污染制造工艺等优势，逐渐成为未来生物农药发展研究方向，因此，平衡阿维菌素产业的发展，开发一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，以解决阿维菌素产业中带来的一些列问题，显得至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中的的缺陷，提供了一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，其绿色高效、制造成本低，制造工艺污染低。
[0006]为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案如下：/>[0007]一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，包括如下步骤：
[0008]步骤1、阿佛曼链霉菌的菌种制备：
[0009]将冷冻保藏的阿佛曼链霉菌菌种接种于茄子瓶斜面培养基上，于28
‑
30摄氏度培养7天，备用；
[0010]步骤2、固体发酵培养：
[0011]步骤2
‑
1、配制固体发酵培养基，并灭菌；
[0012]步骤2
‑
2、取步骤1制备的茄子瓶斜面菌种，用无菌水制成菌种悬浮液；
[0013]步骤2
‑
3、将菌种悬浮液均匀接种于步骤2
‑
1制备的固体发酵培养基中；
[0014]步骤2
‑
4、在卧式固态生物反应器进行固体发酵培养，时间9
‑
11天，至每克物料中活孢子数量大于等于50亿个后，停止发酵；固体发酵培养的培养条件为：无菌空气通气量1：0.2
‑
0.5v/v/min(无菌空气通气量指的是培养基与每分钟内通入的无菌空气的体积比)；反应器压力：0.005
‑
0.01MPa，培养温度28
‑
30摄氏度，培养湿度50
‑
60％。
[0015]进一步的，所述阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，还包括步骤3、活孢子粉的制备：
[0016]将步骤2发酵结束的固体培养物移入双锥旋转鼓风式干燥机中干燥，至物料含水量小于等于10％后，粉碎成60
‑
80目的粉末，即得阿佛曼活孢子粉。
[0017]进一步的，所述茄子瓶斜面培养基，包括如下质量百分比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.03％，琼脂1.8
‑
2.2％，水100mL，pH6.5
‑
7.0。
[0018]进一步的，所述茄子瓶斜面培养基在接种前还需要灭菌，所述茄子瓶斜面培养基的灭菌条件为：于0.11
‑
0.12MPa压力下120摄氏度湿热消毒灭菌30min。
[0019]进一步的，所述固体发酵培养基：先按包括如下质量百分比的各原料复配：谷糠60
‑
70％，麸皮12
‑
15％，豆饼3
‑
5％，花生饼粉3
‑
5％，玉米粉8
‑
10％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.5％，血胨0.1
‑
0.2％，pH自然，保证各原料的百分总量为100％；然后加入水调整湿度为50
‑
60％。
[0020]进一步的，所述固体发酵培养基在接种前还需要灭菌，所述固体发酵培养基的灭菌条件为：于0.11
‑
0.12MPa压力下120摄氏度湿热灭菌30min。
[0021]进一步的，所述活孢子的计数检测方法为：采用双层平板培养计数检验法，进行4个重复，取平均值。
[0022]更进一步的，所述双层平板培养计数检验法，具体包括：
[0023]1、培养基的准备：
[0024]固体培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2.0
‑
2.2％，水100mL，pH6.5
‑
7.0；
[0025]半固体培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂0.8
‑
1.2％，水100mL；将固体培养基和半固体培养基分别装入250mL三角瓶中，每瓶100mL，于0.11
‑
0.12MPa压力下115
‑
120摄氏度灭菌30min，备用；
[0026]2、检验：
[0027]1)、取1g待检样品，用无菌水进行梯度稀释后，取1mL梯度稀释后的菌悬液加入到半固体培养基中，制得含菌半固体培养基；
[0028]2)、将固体培养基加热至熔化后，倒入培养皿中，待固体培养基冷却凝固后，向其中倒入含菌半固体培养基，放平静置，待凝固后，于28
‑
30摄氏度恒温箱中培养，然后记录每个培养皿中单个活孢子菌落的个数；
[0029]每个孢子粉中活孢子个数＝单个活孢子菌落数*稀释倍数。
[0030]更进一步的，所述梯度稀释，采用4级梯度稀释，每级稀释100倍；具体操作如下：将1g待检样品加入100mL无菌水中，得到10
‑2数量级的菌悬液，然后，取1mL10
‑2数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10
‑4数量级的菌悬液，然后取1mL10
‑4数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10
‑6数量级的菌悬液；1mL10
‑6数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10
‑8数量级的菌悬液，即可。
[0031]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0032]本专利技术以固态培养基发酵的方式制备阿佛曼链霉菌活性孢子，其制备方法绿色高效，成本低，制备过程中，不会用到有机溶剂等高污染试剂，安全环保，且无废液排放问题，避免了阿维菌素产业中对环境造成的一些列危害。
[0033]本专利技术在固体发酵过程中，加入大豆饼粉、花生饼粉、玉米粉、血胨作为碳源和氮
源，并辅以硫酸铵作为快速碳源，并加入谷糠和麸皮进行含水量的调节，此外，培养基中血胨的加入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、阿佛曼链霉菌的菌种制备：将冷冻保藏的阿佛曼链霉菌菌种接种于茄子瓶斜面培养基上，于28
‑
30摄氏度培养7天，备用；步骤2、固体发酵培养：步骤2
‑
1、配制固体发酵培养基，并灭菌；步骤2
‑
2、取步骤1制备的茄子瓶斜面菌种，用无菌水制成菌种悬浮液；步骤2
‑
3、将菌种悬浮液均匀接种于步骤2
‑
1制备的固体发酵培养基中；步骤2
‑
4、在卧式固态生物反应器进行固体发酵培养，时间9
‑
11天，至每克物料中活孢子数量大于等于50亿个后，停止发酵；固体发酵培养的培养条件为：无菌空气通气量1：0.2
‑
0.5v/v/min；反应器压力：0.005
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0.01MPa，培养温度28
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30摄氏度，培养湿度50
‑
60％。2.根据权利要求1所述的一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，其特征在于，还包括步骤3、活孢子粉的制备：将步骤2发酵结束的固体培养物移入双锥旋转鼓风式干燥机中干燥，至物料含水量小于等于10％后，粉碎成60
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80目的粉末，即得阿佛曼活孢子粉。3.根据权利要求1所述的一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，其特征在于，所述茄子瓶斜面培养基，包括如下质量百分比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.03％，琼脂1.8
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2.2％，水100mL，pH6.5
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7.0。4.根据权利要求3所述的一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，其特征在于，所述茄子瓶斜面培养基在接种前还需要灭菌，所述茄子瓶斜面培养基的灭菌条件为：于0.11
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0.12MPa压力下120摄氏度湿热消毒灭菌30min。5.根据权利要求1所述的一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，其特征在于，所述固体发酵培养基：先按包括如下质量百分比的各原料复配：谷糠60
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70％，麸皮12
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15％，豆饼3
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5％，花生饼粉3
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5％，玉米粉8
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10％，碳酸钙0....

【专利技术属性】
技术研发人员：暴连群，刘中须，祁桂玲，候慧云，刘天娇，王学伟，
申请(专利权)人：河北兴柏农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：