一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种提高海洋玫瑰杆菌可培养性的通用型分离培养基，属于海洋微生物技术领域。具体的培养基配方为：苹果酸0.15g，β

【技术实现步骤摘要】
一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用


[0001]本专利技术提供了一种提高海洋玫瑰杆菌可培养性的通用分离培养基，属于海洋微生物


技术介绍

[0002]海洋玫瑰杆菌属于α
‑
变形菌纲，在海洋中丰度较高（约占整个浮游细菌群落15%
‑
25%）。分布极为广泛，从近海到外海、从海水表层到海底、从热带到极地海洋，几乎无处不在。常常与海洋浮游植物、藻、动物等形成共生体。具有多样化的生理代谢功能(如好氧不产氧光合作用、一氧化碳氧化、硫化物降解等)，在海洋碳、硫循环和全球气候调节中发挥重要功能。是研究海洋细菌生理生态功能的重要模式生物。可高效降解芘、萘和荧蒽等多环芳烃类化合物。可产生多种生物活性物质，是开发海洋天然活性产物的重要微生物资源。
[0003]尽管已开发了一系列不依赖于微生物纯培养的分子生物学方法，用于微生物多样性研究。但是，微生物的生理特征和代谢功能研究的首要前提是必须分离获得其微生物的纯培养物。
[0004]目前，通常用于海洋细菌分离培养的海洋2216培养基，虽然长期应用于海洋细菌分离实践，但已很难再分离出稀有玫瑰杆菌新物种，其分离效果有待于进一步提高。研发特殊的细菌培养基配方，对于提高海洋玫瑰杆菌的可培养性至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种提高海洋玫瑰杆菌可培养性的通用分离培养基，本专利技术所设计的培养基配方可提高海洋玫瑰杆菌的可培养性，适合于海洋玫瑰杆菌细菌的分离培养，也可用于划线纯化。本专利技术丰富了海洋玫瑰杆菌分离筛选的方法和途径的多样性，一定程度上提高了海洋稀有玫瑰杆菌的可培养性，同时在实践操作过程中可行性强；本专利技术培养基成分易得，其价格低。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基，具体的培养基配方为 ：苹果酸 0.15g、β
‑
羟基
‑
丁酸 0.1g、乙酸钠0.15g、甲酸铵 0.1g、丙酸铵 0.2g、酵母粉0.1g、维生素B12 0.001g、NaCl 5g，天然海水1L，pH为7.0
‑
7.2。
[0007]另一方面，本专利技术提供了一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基的制备，其包括以下步骤：准确称取以下试剂：苹果酸0.15g、β
‑
羟基
‑
丁酸0.1g、乙酸钠0.15g、甲酸铵0.1g、丙酸铵0.2g、酵母粉0.1g、维生素B12 0.001g、NaCl 5g，加入到1L天然海水中，用1M NaOH或HCl溶液调节pH为7.0
±
0.2，配制固体培养基时加入15
‑
20 g琼脂，121℃高温蒸汽灭菌25min，备用。
[0008]另一方面，本专利技术提供一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基在海洋玫瑰杆菌分离筛选中的应用。
[0009]与现有通用培养基2216培养基相比，本专利技术具有以下优点：（1）本专利技术所设计的培养基配方可提高海洋玫瑰杆菌的可培养性，适合于海洋玫
瑰杆菌细菌的分离培养，也可用于划线纯化。该专利技术丰富了海洋玫瑰杆菌分离筛选的方法和途径的多样性，一定程度上提高了海洋稀有玫瑰杆菌的可培养性，同时在实践操作过程中可行性强。
[0010]（2）本专利技术培养基成分易得，其价格低，具有较好的市场应用前景。
具体实施方式
[0011]下面结合实施例，对本专利技术进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。
[0012]本专利技术培养基（RM培养基）的制备：准确称取以下试剂：苹果酸0.15g、β
‑
羟基
‑
丁酸0.1g、乙酸钠0.15g、甲酸铵0.1g、丙酸铵0.2g、酵母粉0.1g、维生素B12 0.001g、NaCl 5g，加入到1L天然海水中，用1M NaOH或HCl溶液调节pH为7.0
±
0.2。配制固体培养基时加入15
‑
20 g琼脂。121℃高温蒸汽灭菌25min，备用。
[0013]2216培养基的制备：准确称取以下试剂：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶0.034、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、硝酸铵0.0016g、磷酸氢二钠0.008g，溶解于1L天然海水中，调节pH值7.6
±
0.2。配制固体培养基时加入15
‑
20 g琼脂。121℃高温蒸汽灭菌25min，备用。
[0014]F2液体培养基制备：准确称取以下试剂：NaNO
3 0.075g、NaH2PO4.2H2O 0.00565g加入到溶解于1L天然海水中，121℃高温蒸汽灭菌25min后。加入1 mL无菌微量元素溶液及1 mL无菌复合维生素溶液，调节pH值8.0。
[0015] 1/2 RM培养基的制备：1/2 RM：所有培养基成分含量为RM培养基的1/2。
[0016]1.5RM培养基的制备：所有培养基成分含量为RM培养基的1.5倍。
[0017]实施例1一种提高海洋玫瑰杆菌可培养性的通用型分离培养基RM，所述的测试样品为链状亚历山大藻藻际细菌的分离。所用链状亚历山大藻，编号为GY
‑
H25，购买自上海光语生物科技有限公司，所述的方法包括以下步骤：（1）藻株的培养：将链状亚历山大藻GY
‑
H25接种于F2培养基，盐度为33
‰
，培养环境温度设置为23℃，光照/黑暗时间为14/10h，连续培养，按时摇晃。
[0018]（2）细菌的分离：取200 mL处于对数生长期的GY
‑
H25藻液于6000 rbp转速下离心收集藻细胞，获得的藻细胞用无菌海水悬浮后，超声波破碎仪破碎海水悬浮后的细胞，用无菌海水依次稀释至10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑
4 4个浓度梯度，每个浓度梯度吸取100 μL均匀涂布下列四种培养基中：对照培养基2216E、1/2RM、1.5RM及RM固体平板培养基，25℃培养1
‑
2周，从中挑取单菌落，转接于固体斜面，于4℃保存。
[0019]（3）分离细菌的分子鉴定：细菌基因组DNA的制备：取待测细菌，分别接种到5 mL下列四种液体培养基中：对照培养基2216E、1/2RM、1.5RM及RM培养基中，接种完成后转入28℃恒温摇床培养3～5 d，细菌DNA提取按照Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒说明书步骤进行操作。PCR通用引物27F：5
’‑
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
‑3’
，1492R：5
’‑
GGTTACCTTGTT ACGACTT
‑3’
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基，其特征在于所述的培养基配方为 ：苹果酸 0.15g、β
‑
羟基
‑
丁酸 0.1g、乙酸钠0.15g、甲酸铵 0.1g、丙酸铵 0.2g、酵母粉0.1g、维生素B12 0.001g、NaCl 5g，天然海水1L，pH为7.0
‑
7.2。2.一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基的制备，其特征在于包括以下步骤：准确称取以下试剂：苹果酸0.15g、β
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞晶，邵欧文，吴哲毅，黄孝君，杨丽雯，刘俊江，张晓玲，杨桥，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：