鉴别无籽油棕的SSR标记引物、应用及方法技术

本发明专利技术涉及种苗繁育技术领域，涉及一种基于与无籽相关的S

【技术实现步骤摘要】
鉴别无籽油棕的SSR标记引物、应用及方法


[0001]本专利技术属于种苗繁育
，涉及分子标记应用的鉴定方法，具体涉及利用SSR标记技术的应用、鉴别无籽油棕的方法。

技术介绍

[0002]油棕是世界重要的油料作物，果实是唯一的产油器官，中果皮压榨得到棕榈油，种子破壳后得到种仁，种仁压榨得到棕榈仁油。目前，商业品种大多为薄壳种(Tenera)和厚壳种(Dura)，油脂压榨过程中均需要破壳工序，其中薄壳种由厚壳种和无壳种(Pisifera)杂交得来。在对油棕种质资源进行鉴定过程中，我们发现一类无籽油棕。具体表现为果实中没有种子和种壳，全部为果肉(图1)。无籽油棕在榨油过程中无需破壳工序，可以直接压榨，减少了加工成本，产油率也会相应提高。
[0003]无籽油棕品种的推广需要大量无籽油棕种苗，种苗的早期鉴定至关重要。油棕商业育苗主要采用种子育苗和组培育苗，幼苗生长3
‑
4年才会开花结果，无籽性状才能观察到。因此，在育苗阶段鉴定种苗基因型十分必要。SSR分子标记技术步骤简单、时间短、成本低，在其他作物中也有大量成功应用的报道。在对无籽、无壳、薄壳油棕雌花转录组分析的基础上，选取可能导致无籽的S
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RNase基因为目的基因，在NCBI中下载金鱼草S
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RNase基因序列(HE805271.1和AJ315593.1)、茄科S
‑
RNase基因序列(D63887.1和AB568389.1)、蔷薇科S
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RNase基因序列(FJ543097.1和AF327223.1)，将这些序列与油棕基因组比对，发现与油棕KE607205.1、ASJS01098507.1、CM002081.1基因组序列相似度较高，随后用这些基因组序列在WebSat在线工具(https://bioinfo.inf.ufg.br/websat/)上设计了20对SSR引物，在华大基因合成引物，最后用于鉴别无籽油棕实验。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于与无籽相关的S
‑
RNase基因序列设计SSR引物，应用SSR分子标记技术在育苗阶段对油棕的无籽性状进行早期鉴定，对于油棕种苗质量控制及种植业发展具有重要意义，在油棕种苗繁育领域应用前景广阔。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供一种鉴别无籽油棕的SSR标记引物，包括两对引物组，分别为P16和P19；所述P16引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述P19引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供鉴别无籽油棕的SSR标记引物在育苗阶段对油棕的无籽性状进行早期鉴定中的应用。
[0007]本专利技术的再一目的在于提供鉴别无籽油棕的方法，步骤如下：
[0008]步骤S1，取0.05
‑
0.1g油棕叶片提取基因组DNA，稀释浓度到200ng/μl；
[0009]步骤S2，配制20ul反应体系对DNA进行PCR扩增，扩增方式为梯度降落法，扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，退火温度从65
°
降到56℃，运行10个循环，每个循环降低1
℃，55℃退火25个循环，每个循环45s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，之后4℃保存；
[0010]步骤S3，PCR产物中加入1μl 6
×
染料混合，取0.8
‑
1.0μl混合液，在6％聚丙烯酰胺凝胶上点样，电泳后银染，观察250
‑
500bp之间的条带情况进行无籽油棕鉴定：250
‑
500bp之间有条带的为有籽油棕(厚壳种、薄壳种、无壳种)，没有条带的为无籽油棕。
[0011]进一步地，步骤S2中，反应体系包含1μl基因组DNA，0.4μl dNTPs，2μl含有MgCl2的10
×
RealTimes buffer，2μl RealTimes Taq DNA聚合酶5Uμl
‑1，0.8μl正向引物10μM，0.8μl反向引物10μM，13μl灭菌超纯水。
[0012]所用引物P16的正向引物序列为：5'
‑
TTAAACGATGAATCCGAGCC
‑
3'，反向引物序列为：5'
‑
CGTGAAGGAGGAGGAAGAAAA
‑
3'；P19的正向引物序列为：5'
‑
TGGTGACGAACATTACCTTGAG
‑
3'，反向引物序列为：5'
‑
TCTCCTGCCCTGATTCTTTAAC
‑
3'。或者由油棕KE607205.1、ASJS01098507.1、CM002081.1基因组序列设计的其他用于鉴别无籽油棕的引物，以及这些引物序列衍生的其他用于鉴别无籽油棕的引物序列。
[0013]本专利技术鉴别无籽油棕的SSR标记引物、应用及方法具有以下的有益效果：
[0014]早期鉴别无籽油棕可以节省育苗成本，促进无籽油棕品种的推广。油棕从种苗定植到结果需3
‑
4年时间，而等到结果性状稳定并发现不是无籽油棕植株可能需要花费大量的人力、物力和财力，从而给种植园造成经济损失，提高无籽油棕推广的成本。本专利技术采用SSR分子标记技术鉴别无籽油棕，可以在育苗阶段将无籽油棕鉴别出来，无需等到多年以后发现果实不是无籽再剔除，从而避免了前期种植过程中人力、物力和财力的浪费，对于油棕种苗质量控制及油棕种植业发展具有重要意义，在油棕种苗繁育领域应用前景广阔。
附图说明
[0015]图1是无籽油棕果实剖面。
[0016]图2是本专利技术共20对SSR标记在厚壳种(有籽)、无壳种(有籽)、薄壳种(有籽)、无籽油棕中的1.0μl PCR扩增产物电泳图。其中，M是DNA分子量标记，从下至上的条带依次为100bp，250bp，500bp，1000bp，2000bp；每个标记下4个样品依次为厚壳种(有籽)、无壳种(有籽)、薄壳种(有籽)、无籽油棕。
[0017]图3是本专利技术标记P16在厚壳种(有籽)、无壳种(有籽)、薄壳种(有籽)、无籽油棕中的1.0μl PCR扩增产物电泳图。其中，M是DNA分子量标记，从下至上的条带依次为100bp，250bp，500bp，1000bp，2000bp；Dura为厚壳种(有籽)，Pisifera为无壳种(有籽)，Tenera为薄壳种(有籽)，Seedless为无籽油棕。
[0018]图4是本专利技术标记P19在厚壳种(有籽)、无壳种(有籽)、薄壳种(有籽)、无籽油棕中的1.0μl PCR扩增产物电泳图。其中，M是DNA分子量标记，从下至上的条带依次为100bp，250bp，500bp，1000bp，200本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鉴别无籽油棕的SSR标记引物，其特征在于：包括两对引物组，分别为P16和P19；所述P16引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述P19引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的鉴别无籽油棕的SSR标记引物在育苗阶段对油棕的无籽性状进行早期鉴定中的应用。3.根据权利要求2所述应用的鉴别无籽油棕的方法，其特征在于，步骤如下：步骤S1，取0.05
‑
0.1g油棕叶片提取基因组DNA，稀释浓度到200ng/μl；步骤S2，配制20ul反应体系对DNA进行PCR扩增，扩增方式为梯度降落法，扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，退火温度从65
°
降到56℃，运行10个循环，每个循环降低1℃，55℃退火25个...

【专利技术属性】
技术研发人员：石鹏，张大鹏，王永，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院椰子研究所，
类型：发明
国别省市：