一种菌群双层平板计数法制造技术

本发明专利技术提供一种菌群双层平板计数法，其特征在于：依次包含如下步骤，步骤1：制备样品匀液和样品稀释液；步骤2：取1mL样品稀释液加入无菌培养皿中；步骤3：将灭菌后的非选择性培养基倒入培养皿中，铺成平板，放置，使样品中的菌群得到修复；步骤4：在修复后的平板上倒入选择性培养基，平铺，培养；步骤5：计数菌群。本发明专利技术中通过增加修复步骤，使得灵敏度显著高于国标法，大大提高检出率，且具备成本低、操作简便的优势，具有实用性。具有实用性。具有实用性。

【技术实现步骤摘要】
一种菌群双层平板计数法


[0001]本专利技术涉及新型微生物分离检测技术，尤其涉及检出冷冻饮食品中菌群的领域。

技术介绍

[0002]大肠菌群定义为在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群作为食品卫生评价的重要微生物检测指标，在食品安全中受到严格监控，同时也是冷冻饮食品控制的重要指标。
[0003]冷冻饮食品大肠菌群检验通常依据食品安全国家标准《食品微生物学检验大肠菌群》(GB4789.3-2016)第二法，使用结晶紫中性红胆盐琼脂(violet red bile agar,VRBA)进行大肠菌群培养并计数。但是，冷冻饮食品中的大肠菌群处于冷冻环境，使其遭受不同程度的亚致死性损伤成为损伤菌，亚致死损伤菌是指在非选择性培养基中可形成菌落，而在选择性培养基上不能形成菌落，当所处环境适宜，亚致死状态下的微生物会复苏并且恢复繁殖能力。VRBA作为选择性培养基其含有一定的抑菌物质，冷冻受损后的大肠菌群表现为对选择性培养基VRBA不敏感，若不经过修复直接用国标平板法进行检测很难使损伤菌生长，则会导致冷冻饮食品的大肠菌群检出率低。

技术实现思路

[0004]要解决的技术问题
[0005]本专利技术的目的是，提供一种可提高菌群检出率的方法。
[0006]解决问题的技术方案
[0007]本专利技术提供一种菌群双层平板计数法，其特征在于：依次包含如下步骤，
[0008]步骤1：制备样品匀液和样品稀释液；
[0009]步骤2：取1mL样品稀释液加入无菌培养皿中；
[0010]步骤3：将灭菌后的非选择性培养基倒入培养皿中，铺成平板，放置，使样品中的菌群得到修复；
[0011]步骤4：在修复后的平板上倒入选择性培养基，平铺，培养；
[0012]步骤5：计数菌群。
[0013]所述菌群优选为大肠菌群。
[0014]所述非选择性培养基优选为大豆酪蛋白琼脂(tryptose soya agar,TSA)培养基。
[0015]所述选择性培养基优选为结晶紫中性红胆盐琼脂(violet red bile agar,VRBA)培养基。
[0016]优选所述步骤1、步骤2、步骤4、步骤5是按照GB4789.3-2016第二法进行。
[0017]所述步骤3中，优选将灭菌后的非选择性培养基降至45-50℃时倒入培养皿中，使得8-10mL/平皿，铺成平板，于室温放置，使样品中的菌群得到修复。
[0018]所述步骤3中，优选将灭菌后的非选择性培养基降至45℃时倒入培养皿中。
[0019]所述步骤4中，优选在修复后的平板上倒入45℃的VRBA培养基，使得10-12mL/平
皿，铺平，待培养基凝固后于36℃培养24h。
[0020]所述步骤3中，优选于室温放置2
±
0.5h，使样品中的菌群得到修复。
[0021]所述步骤3中，优选于室温放置2h，使样品中的菌群得到修复。
[0022]有益效果
[0023]根据本专利技术的菌群的检出方法，通过增加修复步骤，能够大大提高菌群的检出率，灵敏度显著高于国标法，具有明显的优势，且具备成本低、操作简便的优势，具有实用性。
附图说明
[0024]图1是本专利技术的大肠菌群双层平板侧视图照片。
[0025]图2是国标法大肠菌群检测结果照片。
[0026]图3是本专利技术的双层平板法大肠菌群检测结果照片。
具体实施方式
[0027]本专利技术中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，本专利技术中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0028]本专利技术中的大豆酪蛋白琼脂(TSA)培养基制备如下：胰蛋白胨15.0g，大豆胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL。将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.3
±
0.2，分装锥形瓶，121℃高压灭菌15min。
[0029]本专利技术中的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)培养基制备如下：蛋白胨7.0g/L，酵母粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，乳糖10.0g/L，胆盐1.5g/L，结晶紫0.002g/L，中性红0.03g/L，琼脂15.0g/L。将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH至7.4
±
0.1，煮沸2min备用。VRBA培养基在使用前临时制备，不得超过3h。
[0030]根据本专利技术的优选的实施方式，提供针对冷冻饮食品中大肠菌群的双层平板检出方法，该双层平板检出方法依次包括如下步骤：
[0031]步骤1：依据GB4789.3的操作要求，称取25g冷冻饮品样品放入盛有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液，再根据样品的污染程度，选择1～2个适当的稀释度制作稀释液。
[0032]步骤2：取1mL样品稀释液加入无菌培养皿中。
[0033]步骤3：待灭菌后的TSA培养基温度降至45-50℃时，快速倒入培养皿中，约8-10mL/平皿，混匀，铺成平板，于室温放置2
±
0.5h，使样品中的大肠菌群得到修复。该步骤采用非选择性培养基的TSA培养基对冷冻样品中损伤的大肠菌群进行修复，是本专利技术的关键步骤，也是本专利技术区别于国标单层平板的关键步骤。
[0034]步骤4：在修复后的平板上倒入45-50℃的VRBA培养基，约10-12mL/平皿，铺平，待培养基凝固后于36℃培养24h。该步骤创造了一层选择性环境，抑制样品中其他修复微生物的生长，选择性的分离大肠菌群菌株。
[0035]步骤5：依据GB4789.3的计数要求对平板大肠菌群进行计数。
[0036]本专利技术的关键步骤是上述具体步骤中的步骤3，主要意义在于该步骤采用非选择性培养基的TSA培养基对冷冻样品中损伤的大肠菌群进行修复，是本专利技术区别于国标单层平板的关键步骤。
[0037]上述步骤中的步骤1、步骤2、步骤4、步骤5同国标GB4789.3，属于国标检验流程。步骤3是本专利技术的重要步骤，是提高大肠菌群检出率的核心手段。由此可见，通过进行步骤3的修复，使得菌群检出率大大提高。
[0038]此外，本专利技术的上述各个步骤之间必须严格按照先后顺序进行。
[0039]本专利技术的菌群的检出方法还适合用于冷冻食品中，如用于冷冻肉类、冷冻水果等的大肠菌群的检测中。
[0040]下面，通过实施例对本专利技术的菌群的检出方法与国标法进行比较，并对菌群的修复时间进行考察。
[0041]实施例1
[0042]从市场随机采集32个冷冻饮品(冰淇淋、冰棍、雪糕等产品)，按照上述步骤1-5进行双层平板法大肠菌群检测。其中，在步骤3中，于室温放置2小时。在步骤3和步骤4中，培养基的温度选择45℃。
[0043]针对该32个冷冻饮品，同时按照国标法进行大肠菌群检测。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菌群双层平板计数法，其特征在于：依次包含如下步骤，步骤1：制备样品匀液和样品稀释液；步骤2：取1mL样品稀释液加入无菌培养皿中；步骤3：将灭菌后的非选择性培养基倒入培养皿中，铺成平板，放置，使样品中的菌群得到修复；步骤4：在修复后的平板上倒入选择性培养基，平铺，培养；步骤5：计数菌群。2.根据权利要求1所述的菌群双层平板计数法，其特征在于：所述菌群为大肠菌群。3.根据权利要求1所述的菌群双层平板计数法，其特征在于：所述非选择性培养基为大豆酪蛋白琼脂培养基即TSA培养基。4.根据权利要求1所述的菌群双层平板计数法，其特征在于：所述选择性培养基为结晶紫中性红胆盐琼脂培养基即VRBA培养基。5.根据权利要求1所述的菌群双层平板计数法，其特征在于：所述步骤1、步骤2、步骤4、步骤5是按照GB4789.3-2016第二法进行。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：张祁，黄小平，裴晓燕，韩晓旭，齐炳理，
申请(专利权)人：内蒙古乳业技术研究院有限责任公司，
类型：发明
国别省市：