靶向物介导的核酸纳米制剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种靶向物介导的核酸纳米制剂及其制备方法。本发明专利技术特别涉及一种转铁蛋白(Tf)介导的LNP(Tf

【技术实现步骤摘要】
receptor,TfR)。有研究表明，在许多肿瘤细胞系和从患者获得的肿瘤样本中均检测到了高表达的TfR。已有研究者尝试将Tf作为纳米药物递送载体的靶向物，例如，Wang等人(Wang,et al,International Journal of Nanomedicine,2012,7,2513
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2522)首先制备了固体脂质纳米粒(SLNs)，与pDNA复合后，通过向溶液中掺入Tf
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PEG
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PE，以对SLNs表面进行修饰，将SLNs对于HepG2实体瘤的pDNA体内递送效率相较于无靶向组提高了约2倍；Zhang等人(Zhang,et al,Oncology Reports,2017,37,937
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944)通过掺入法制备了Tf
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PEG
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DSPE和HA
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PEG
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DSPE双靶向修饰的纳米结构脂质载体(NLCs)，将NLCs对A549实体瘤的pDNA体内递送效率相较于无靶向组提高了约2倍；Li等人(Li,et al.Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,and Medicine,2017,13,371
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381)通过三通道微流控芯片，首先制备了包载存活蛋白(survivin)siRNA的LNP中间体，然后将Tf
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PEG
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chol插入LNPs表面，所得的靶向LNP对HepG2实体瘤的生长抑制效率相较于无靶向组提高了约50％。同时，目前已有两项以Tf作为靶向物的抗肿瘤纳米制剂进入了临床阶段。MBP
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426是由Mebiopharm公司开发的脂质体制剂，在包载奥沙利铂后，将脂质体表面的活性基团键合Tf的氨基，实现了对脂质体的Tf修饰。该一期临床试验中，对进展期肿瘤或转移型肿瘤的患者每三周静脉输注该靶向脂质体制剂，耐受性良好。CALAA
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01是由Arrowhead主导的全球首款进入临床试验的肿瘤治疗siRNA靶向纳米制剂。其主要成分为环糊精、PEG
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金刚烷和Tf
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PEG
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金刚烷，由环糊精静电结合siRNA后，PEG
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金刚烷对载体进行稳定，Tf对患者的实体瘤进行靶向。由于该载体的体内稳定性较差，约21％的患者由于不良反应而退出了临床试验。尽管如此，对患者的黑色素瘤样本切片的分析结果表明，siRNA在肿瘤组织中有剂量相关性积累，相关基因的表达受到了抑制，并且癌旁组织中siRNA蓄积量显著低于肿瘤，表明Tf确实有良好的体内肿瘤靶向性。
[0007]目前在LNP、脂质体、SLN、NLC等以脂质为主要成分的脂质载体表面修饰靶向物(如Tf)的方式主要为以下两种：(1)掺入法，首先制备脂质载体，然后在经过透析、超滤、切向流过滤等方法去除有机溶剂、使脂质载体稳定后，向溶液中加入连接有靶向物(如Tf)的脂质。靶向物脂质具有两亲性，其疏水基团会插入到脂质载体的脂质层中，从而完成对脂质载体的靶向物修饰。掺入法的具体方法可参考前述Zhang等人和Wang等人公开的方法。(2)化学键合法，在制备脂质载体时加入含有活性基团A的脂质材料，这里的脂质主要指PEG化脂质，如PEG
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DMG、PEG
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DSPE等，活性基团A主要指可以在无需额外添加催化剂的温和条件下与另一基团B高效反应的基团对，如叠氮(A)—大环炔(B)，N
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羟基琥珀酰亚胺(A)—氨基(B)，马来酰亚胺(A)—巯基(B)等，活性基团通常连接在PEG末端。完成脂质载体的制备后，将靶向物(如Tf)首先用活性基团B修饰，然后加入到脂质载体的溶液中，匀速搅拌混合使A与B反应，完成对脂质载体的靶向物修饰。化学键合法的具体方法可参考专利CN101170995B和专利US20190062788A1。
[0008]然而，以上脂质载体表面靶向物(如Tf)修饰方式存在诸多缺陷：
[0009]对于掺入法，其存在的缺陷包括但不限于：(1)靶向物修饰的聚合物缀合脂质的插入效率不明确/低下，由于靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf
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PEG
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DMG)是在LNP已组装完成的情况下加入的，因此所述靶向物修饰的聚合物缀合脂质需要插入LNP的脂质层才能完成修饰，否则会以单分子胶束或聚集胶束的形式存在于溶液中，成为杂质。由于组装完成的LNP表面已覆盖有一层聚合物缀合脂质(如PEG
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DMG)，聚合物(如PEG)的空间位阻会导致新加入的靶向物脂质难以高效插入LNP脂质层，因此掺入法修饰效率不明确/低下，而过量加
入靶向物修饰的聚合物缀合脂质会造成原料浪费并使得后续纯化未掺入LNP中的游离的靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如游离的Tf
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PEG脂质)的工作更为繁琐复杂；(2)靶向物修饰的聚合物缀合脂质的投料量大且需要在制备靶向物介导的LNP(如Tf
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LNP后)去除游离的靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf
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PEG脂质)，费时费力；(3)修饰过程中脂质纳米颗粒的结构变化可能降低药效、生产批间差较大等，因此难以进行放大生产，未能进入临床研究阶段。此外，由于核酸药物通常对温度比较敏感，因此相关药物制剂的制备流程应尽可能短、制备工艺尽可能简单，减少核酸药物在4℃
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25℃范围内的降解过程。
[0010]对于化学键合法，其存在的缺陷包括但不限于：(1)需要对A—B基团的反应温度、反应时长、投料比、反应效率进行详细的研究，且反应完毕后还需要额外步骤来去除未反应的靶向物；(2)活性基团的稳定性难以完全得到保证，如N
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羟基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺比较容易水解，大环炔比较容易氧化。因此，若脂质纳米颗粒在完成制备到进行靶向物(如Tf)修饰之间的间隔过长，会较大地降低修饰效率；(3)化学修饰后需要去除未反应的靶向物(如Tf)，费时费力。
[0011]另外，而无论是化学键合法还是掺入法，在脂质纳米颗粒的标准生产流程之外都需要额外加入修饰步骤，为核酸药物的稳定性带来了不利影响，进一步增加了质量控制的难度。
[0012]为了克服以上缺陷，本专利技术以微流控生产技术为基础，通过将靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf
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PEG2k
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DMG脂质)与初始物料按一定顺序和比例混合后，采用一步法实现对核酸药物的包封，达到制备靶向物修饰LNP的目的。具体地，本方法具有以下优势：(1)微流控生产LNP的技术是一项比较成熟的核酸药物制剂生产技术，工艺稳定性好、流程简单，放大参数可预期，有相关产品上市(等)；(2)本专利技术的制备方法中，靶向物修饰的聚合物缀合脂质使用量低，减少制备工艺过程中的物料浪费，大大降低生产成本；(3)本专利技术的方法与已有策略相比，无需检测和去除未反应的靶向物基团，因此具有更精准的质控，且制备靶向本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备靶向物介导的脂质纳米颗粒(LNP)的方法，包括以下步骤：将靶向物修饰的聚合物缀合脂质溶于二甲亚砜(DMSO)、N,N
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二甲基甲酰胺(DMF)、1,4
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二氧六环，或N
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甲基吡咯烷酮(NMP)中，即为溶液A；将可离子化脂质(优选可离子化阳离子脂质)、中性脂质、胆固醇或其类似物，和聚合物缀合脂质溶于乙醇中，即为溶液B；将所述溶液A加入所述溶液B中进行混合，即为溶液C；将核酸溶于pH3.0
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5.0的缓冲液(如苹果酸或柠檬酸或醋酸缓冲液)中，即为溶液D；将所述溶液C与所述溶液D以体积比为约1:3的比例混合(优选在微流控芯片中混合)，即为溶液E；其中所述溶液E中，所述核酸的量优选占所述溶液E中所述可离子化脂质(优选可离子化阳离子脂质)量的2％至10％质量百分比(优选6％
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9％质量百分比，更优选8.8％质量百分比)；可选地，纯化所述溶液E，并优选收集所述靶向物介导的脂质纳米颗粒。2.如权利要求1所述的方法，其中所述纯化步骤包括将充分混合后的所述溶液E在pH＝7.4PBS或pH＝8.0Tris缓冲液中透析16h。3.如权利要求2所述的方法，其中所述pH＝7.4PBS或pH＝8.0Tris缓冲液中含有冷冻保护剂；优选地，所述冷冻保护剂选自甘油、海藻糖、蔗糖；更优选地，所述pH＝7.4PBS或pH＝8.0Tris缓冲液中含有5
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8％质量浓度的蔗糖。4.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中：所述靶向物修饰的聚合物缀合脂质中的所述靶向物选自配体、受体、蛋白质、小分子、半抗原、抗体和/或其抗原结合片段，优选为转铁蛋白(Transferrin,Tf)；和/或所述可离子化脂质(优选可离子化阳离子脂质)选自二亚油酰基
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甲基
‑4‑
二甲基氨基丁酸酯(Dlin
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MC3
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DMA)、十七烷
‑9‑
基
‑8‑
((2
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羟乙基)(6
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氧代
‑6‑
((癸氧基)己基)氨基)辛酸酯(SM
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102)、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ
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DLenDMA、DLin
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C
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DAP、DLin
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DAC、DLin
‑
MA、DLinDAP、DLin
‑
S
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DMA、DLin
‑2‑
DMAP、DLin
‑
TMA.Cl、DLin
‑
TAP.Cl、DLin
‑
MPZ、DLinAP、DOAP)、DLin
‑
EG
‑
DMA、DLin
‑
K
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DMA或其类似物、(3aR,5s,6aS)
‑
N,N
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二甲基
‑
2,2
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二((9Z,12Z)
‑
十八
‑
9,12
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二烯基)四氢
‑
3aH
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环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯
‑5‑
胺、DLin
‑
K
‑
C2
‑
DMA、3
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((6Z,9Z,28Z,31Z)
‑
三十七
‑
6,9,28,31
‑
四烯
‑
19
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基氧)
‑
N,N
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二甲基丙
‑1‑
胺(MC3醚)，或4
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((6Z,9Z,28Z,31Z)
...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫旭，孙晶，黄新宇，郝肖瑶，
申请(专利权)人：南京吉迈生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：