乙烯形成酶基因VdEFE在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用制造技术

本发明专利技术提供了乙烯形成酶基因VdEFE在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用，属于功能基因技术领域。本发明专利技术对VdEFE基因的功能进行了研究，利用同源重组原理获得VdEFE基因敲除体、互补体和过表达体，通过乙烯和琥珀酸含量的测定，明确VdEFE基因在乙烯合成过程中的作用，明确VdEFE基因与EFE乙烯合成途径的关系；通过生物学性状测定和致病性鉴定，明确VdEFE基因在大丽轮枝菌菌落生长速度、微菌核产量、分生孢子产量和致病力中的作用，推断乙烯在大丽轮枝菌与棉花互作过程中的作用，为大丽轮枝菌防治提供理论依据，为进一步分析大丽轮枝菌与寄主植物的相互作用机制奠定基础。丽轮枝菌与寄主植物的相互作用机制奠定基础。丽轮枝菌与寄主植物的相互作用机制奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
乙烯形成酶基因VdEFE在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用


[0001]本专利技术属于功能基因
，具体涉及乙烯形成酶基因VdEFE在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用。

技术介绍

[0002]1984年，首次报道大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)在生长发育及与寄主互作的过程中具有产生乙烯的能力(Fukuda et al.,1984)。2016年，张婷等发现大丽轮枝菌强、弱致病力菌株都能产生乙烯，且强致病力菌株产生的乙烯含量明显高于弱致病力菌株(张婷等，2016)。在基因功能研究的过程中，也发现有些基因与乙烯的产生存在联系。大丽轮枝菌中VGB和VdPKAC1的基因缺失突变体不仅能导致病原菌致病力降低，微菌核减少，还导致乙烯生物合成量的减少(Tzima et al.,2012；Tzima et al.,2010)。2017年，Zhang Ting等发现大丽轮枝菌黑色素合成相关基因VdPKS1，该基因敲除后，大丽轮枝菌致病力下降，不产生黑色素，并且降低了VGB和VdPKAC1的基因表达，进一步实验发现VdPKS1敲除后降低乙烯生物量合成(Zhang et al.,2017)。2012年，郭惠珊课题组发现VdNLP家族基因编码坏死和乙烯诱导蛋白，其中VdNLP1和VdNLP2编码的蛋白也具有激发子活性，可以激活乙烯生物合成途径和依赖SA、JA的防御信号通路(Santhanam et al.,2013；Zhou et al.,2012)。2019年，Tsolakidou发现VdACCd基因，该基因编码ACC转氨酶(ACC deaminase)，可以通过该酶将乙烯合成前体ACC进行消化，该基因缺失突变体中ACC含量增加，毒力降低，而乙烯的产生量差异不明显，提出ACC充当信号分子，参与大丽轮枝菌与植物的互作(Tsolakidou et al.,2019)。然而目前并未明确大丽轮枝菌中乙烯形成酶基因VdEFE与乙烯合成途径之间是否有关。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种乙烯形成酶基因VdEFE的新应用，具体VdEFE在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用。
[0004]本专利技术提供了乙烯形成酶基因VdEFE在大丽轮枝菌生物合成中的应用。
[0005]优选的，所述生物合成包括乙烯合成和琥珀酸合成。
[0006]本专利技术提供了乙烯形成酶基因VdEFE下调大丽轮枝菌乙烯形成相关基因表达量中的应用。
[0007]本专利技术提供了乙烯形成酶基因VdEFE在维持大丽轮枝菌的生长发育中的应用。
[0008]优选的，所述生长发育包括生长速度和繁殖体产量。
[0009]优选的，所述繁殖体包括微菌核和分生孢子。
[0010]优选的，所述乙烯形成酶基因VdEFE的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0011]本专利技术提供了乙烯形成酶基因VdEFE在大丽轮枝菌生物合成中的应用。为了明确VdEFE基因敲除是否影响大丽轮枝菌产生乙烯的能力，以野生型V592为对照，对VdEFE基因
敲除突变体进行了乙烯含量的测定，结果表明，敲除体Δvdefe产生的乙烯明显低于野生型V592，仅为V592的49.01％。互补体EC
‑
vdefe的乙烯含量恢复与V592无明显差异，而过表达突变体OE
‑
vdefe产生的乙烯明显高于野生型V592和敲除体Δvdefe，乙烯含量分别是V592和vdefe的1.73倍和3.53倍。通过在培养基中添加了EFE通路的唯一底物2
‑
氧化戊二酸(OXO)，结果表明OXO能使所有菌株产生更多的乙烯，并且在OXO诱导下，野生型V592的乙烯含量显著高于敲除体Δvdefe的乙烯含量。说明VdEFE基因与乙烯形成相关，并且是EFE途径中的关键基因。敲除体Δvdefe的琥珀酸含量与野生型V592和互补体EC
‑
vdefe无明显差异，而过表达体OE
‑
vdefe的琥珀酸含量明显高于野生型V592和其他突变体，约为野生型V592的1.5倍，这说明VdEFE基因与大丽轮枝菌琥珀酸形成相关，VdEFE基因是乙烯形成酶基因。
[0012]本专利技术提供了乙烯形成酶基因VdEFE在维持大丽轮枝菌的生长发育中的应用。试验证明，敲除体Δvdefe
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1和Δvdefe
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2的生长速率较野生型明显下降。互补体EC
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vdefe
‑
1和EC
‑
vdefe
‑
2的生长速率有所恢复，与野生型差异不明显，这说明VdEFE基因的敲除影响大丽轮枝菌的生长速率。微菌核产量测定，野生型V592可以产生大量的黑色微菌核，而敲除体ΔVdefe
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1和ΔVdefe
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2形成的黑色微菌核明显少于野生型V592；互补体ECvdefe
‑
1和ECvdefe
‑
2与野生型V592形成的微菌核数量得到明显恢复，这说明VdEFE基因对大丽轮枝菌微菌核的形成有一定影响。产分生孢子量测定结果表明，与野生型V592和互补菌株ECvdefe
‑
1、ECvdefe
‑
2相比，敲除体Δvdefe
‑
1和Δvdefe
‑
2的产孢量显著减少，这说明VdEFE基因与大丽轮枝菌产孢能力密切相关。
附图说明
[0013]图1为VdEFE与其它微生物基于乙烯形成酶氨基酸序列构建的系统进化树；
[0014]图2为VdEFE基因敲除体、互补体和过表达体的验证；图2A：VdEFE敲除载体构建策略示意图；图2B：基因组水平检测VdEFE基因的敲除；DL2000为Marker，CK为阴性对照；图2C：利用RT
‑
qPCR对VdEFE基因的转录水平进行验证；**表示经Duncan检验与V592相比差异显著(P<0.01)；图2D：利用RT
‑
qPCR对VdEFE基因的过表达体转录水平进行确定，不同小写字母表示经Duncan检验差异显著(P<0.05)；
[0015]图3为VdEFE突变体在非诱导条件和底物OXO诱导条件下乙烯含量的测定；其中，不同小写字母表示在查氏培养基处理中按Tukey检验差异显著(P<0.05)。不同大写字母表示在添加OXO的查氏培养基处理中经Tukey检验差异显著(P<0.05)；**表示添加OXO处理与非添加处理在0.01概率水平上具有显著性差异(P<0.01)；误差线表示3次重复计算的标准误差；
[0016]图4为VdEFE基因突变体琥珀酸含量的检测；不同小写字母表示按Tukey检验差异显著(P<0.05)；
[0017]图5为乙烯形成相关基因在野生型菌株V592和VdEF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.乙烯形成酶基因VdEFE在大丽轮枝菌生物合成中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述生物合成包括乙烯合成和琥珀酸合成。3.乙烯形成酶基因VdEFE在下调大丽轮枝菌乙烯形成相关基因表达量中的应用。4.乙烯形成酶基因VdEFE在大丽轮枝菌的生长发育中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄家风，李彪，都业娟，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：