非病毒DNA载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)治疗剂的用途制造技术

本申请描述了一种用于递送和表达转基因的具有线性连续结构的ceDNA载体。所述ceDNA载体包含两侧是两个ITR序列的表达盒，其中所述表达盒编码转基因，所述转基因编码PAH蛋白。一些ceDNA载体进一步包含顺式调控元件，包括调控开关。本文进一步提供了使用所述ceDNA载体进行可靠的体外、离体和体内PAH蛋白的基因表达的方法和细胞系。本文提供了包含可用于在细胞、组织或受试者中表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法和组合物，以及用表达PAH蛋白的所述ceDNA载体治疗疾病的方法。这种PAH蛋白可以表达用于治疗疾病，例如苯丙酮尿症(PKU)。例如苯丙酮尿症(PKU)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】非病毒DNA载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)治疗剂的用途
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2019年3月13日提交的第62/817,771号美国临时申请以及2019年6月5日提交的第62/857,514号美国临时申请的优先权，所述临时申请中的每一个的内容特此以全文引用的方式并入本文中。
[0003]序列表
[0004]本申请含有序列表，其已经以ASCII格式以及本文的表1
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15中的序列电子提交并各自特此通过全文引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2020年3月10日，被命名为131698
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05720_SL.txt并且大小为116,806字节。


[0005]本专利技术涉及基因疗法领域，包括用于在受试者或细胞中表达转基因或经分离的多核苷酸的非病毒载体。本公开还涉及核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，包括多核苷酸以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。例如，本公开提供了使用非病毒ceDNA载体从细胞表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)的方法，例如，表达用于治疗患有苯丙酮尿症(PKU)的受试者的PAH治疗蛋白。该方法和组合物可用于例如通过在有对其需要的受试者的细胞或组织中表达PAH来治疗疾病。

技术介绍

[0006]基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结局。基因疗法包括治疗或预防因可能导致病症、疾病、恶性病等的缺陷基因或者异常调节或表达、例如表达不足或过表达所引起的医学病状。例如，可以通过向患者递送矫正性遗传物质来治疗、预防或改善由缺陷基因引起的疾病或病症，或可以通过例如对患者用矫正性遗传物质改变或沉默缺陷基因，使得该遗传物质在患者体内发生治疗性表达来治疗、预防或改善。
[0007]基因疗法的基础是向转录盒提供活性基因产物(有时称为转基因)，例如能够产生正向功能获得效应、负向功能丧失效应或另一结果的活性基因产物。此类结果可归因于治疗蛋白(例如抗体、功能性酶或融合蛋白)的表达。基因疗法也可以用于治疗由其他因素引起的疾病或恶性疾病。人类单基因病症可以通过将正常基因递送给目标细胞并表达来治疗。矫正基因在患者目标细胞中的递送和表达可以通过多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。
[0008]腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且更具体地说，组成依赖病毒属。源自于AAV的载体(即重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质具有吸引力，因为(i)它们能够感染(转导)多种多样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结
构基因，从而减弱了宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒被认为在人类中是非致病性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV相比，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因，并且通常作为附加体存留，从而限制了插入诱变或基因毒性的风险；以及(v)与其他载体系统相比，AAV载体通常被认为是相对较弱的免疫原，因此不会触专利技术显的免疫应答(参见ii)，从而获得了载体DNA的持久性以及治疗性转基因的潜在长期表达。
[0009]然而，使用AAV颗粒作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其对异源DNA的约4.5kb的病毒封装容量有限(Dong等人，1996；Athanasopoulos等人，2004；Lai等人，2010)，因此AAV载体的使用已限于小于150,000Da蛋白质编码容量。第二个缺点是，由于群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，所述免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的所述载体作出应答，以刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
[0010]另外，通过引入一种或多种含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生具有衣壳的常规AAV病毒粒子(Grimm等人，1998)。然而，发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型，并且衣壳还诱导免疫应答。
[0011]相应地，由于单次施用于患者(因患者免疫应答)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒封装容量(约4.5kb)而受限，以及AAV介导的基因表达缓慢，因此基因疗法使用腺相关病毒(AAV)载体受到限制。
[0012]苯丙酮尿症(PKU)是一种罕见的遗传性先天性代谢缺陷，由PAH基因突变引起。苯丙酮尿症(PKU)是一种先天性代谢缺陷，导致氨基酸苯丙氨酸的代谢降低。未经治疗，PKU可导致智力障碍、癫痫发作、行为问题和精神障碍。它还可能导致发霉的气味和较浅色的皮肤。PKU治疗不佳的母亲所生的婴儿可能有心脏问题、小头和低出生体重。PKA是由于PAH基因的突变引起的，突变导致苯丙氨酸羟化酶(PAH)水平低，即患有PKU的受试者的PAH发生突变，导致其酶活性不足。PKU是常染色体隐性遗传，这意味着该基因的两个拷贝都必须发生突变才能使病情发展。有两种主要类型，经典PKU和变异PKU，取决于是否保留任何酶功能。那些携带一个突变PAH基因拷贝的人通常没有症状。
[0013]PAH是一种酶，通常在肝脏中表达，是将膳食苯丙氨酸代谢为酪氨酸所必需的，酪氨酸是一种负责产生神经递质的氨基酸。PAH催化苯丙氨酸羟基化为酪氨酸。有缺陷的PAH酶会导致膳食苯丙氨酸积累到潜在的毒性水平。
[0014]PKU可由苯丙氨酸羟化酶(PAH)中的单基因缺陷引起，从而导致血清Phe水平升高。PAH在脊椎动物中将Phe转化为酪氨酸。在没有PAH的情况下，去除Phe的唯一其他机制是蛋白质合成和轻微的降解途径，涉及丙氨酸侧链的脱氨基和氧化脱羧，从而产生PKU患者尿液中所见的特征性苯乳酸和乙酸苯酯。不幸的是，典型的饮食中含有的Phe比在没有PAH的情况下可以消除的多。PKU患者体内Phe的累积导致许多症状，包括大脑发育异常和严重的智力低下。(Kaufman,Proc Nat'l Acad Sci USA(美国国家科学院学报)96:3160
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3164,
1999)。
[0015]目前的护理标准是严格限制饮食(限制苯丙氨酸(Phe))，但并不总是有效，因为这种饮食限制难以维持并且不能纠正潜在的缺陷。目前对PKU的治疗是减少含有苯丙氨酸和特殊补充剂的食物的饮食。严格的饮食必须在出生后尽快开始，并至少持续10年，如果不是终生的话。药物沙丙蝶呤二盐酸盐可用于某些PKU患者。如果不及时治疗，PKU会导致进行性和严本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种闭合端DNA(ceDNA)载体，其包含：在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一种异源核苷酸序列，其中至少一种异源核苷酸序列编码至少一种PAH蛋白，其中编码至少一种PAH蛋白的所述至少一种异源核苷酸序列选自与表1中的任何序列具有至少90％同一性的序列。2.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含启动子，所述启动子操作性连接到编码至少一种PAH蛋白的至少一种异源核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:191具有至少85％同一性的核酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含增强子。5.根据权利要求1至4中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含5'UTR和/或内含子序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含3'UTR。7.根据权利要求1至6中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个poly A序列。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个可操作地连接到至少一种异源核苷酸序列的启动子。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列是cDNA。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个ITR包含功能末端解析位点和Rep结合位点。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来自病毒，所述病毒选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或不对称的。13.根据权利要求12所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或基本对称的。14.根据权利要求12所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是不对称的。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是野生型，或其中所述ITR中的两个都是野生型。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自表2中所示的病毒血清型对。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个包含选自表3、表5A、表5B或表6中的序列的序列。19.根据权利要求1
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18中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的至少一个是由野生型AAV ITR序列通过影响所述ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而变成。20.根据权利要求1
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19中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来源于AAV血清型，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
21.根据权利要求1
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20中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是合成的。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个不是野生型ITR，或其中所述ITR中的两个都不是野生型。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过在选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的至少一个ITR区域中进行缺失、插入和/或取代而经修饰。24.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎
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环结构的全部或一部分发生缺失。25.根据权利要求1
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24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎
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环结构的全部或一部分发生缺失。26.根据权利要求1
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24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述C和C'区域形成的茎
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环结构的全部或一部分发生缺失。27.根据权利要求1
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24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎
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环结构的一部分和/或通常由所述C和C'区域形成的茎
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环结构的一部分发生缺失。28.根据权利要求1
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27中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎
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环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎
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【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：世代生物公司，
类型：发明
国别省市：