一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法技术

本发明专利技术设计一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，在构建乙酰辅酶A合成酶ACS基因与乙酰辅酶A羧化酶ACC1基因的重组表达质粒的基础上，将重组质粒分别转化大肠杆菌和酵母细胞，表达目的蛋白，并将纯化的ACS与ACC1重组蛋白加入柚皮素体外酶促合成体系中，实现了丙二酰辅酶A的再生，以及以4

【技术实现步骤摘要】
一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法


[0001]本专利技术涉及一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，分类号为C12N9，属于生物医药


技术介绍

[0002]丙二酰辅酶A（malonyl
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coenzyme A）是一种辅酶A衍生物。作为一种关键的中间代谢物，丙二酰辅酶A在多种代谢途径中发挥重要作用，是细胞内合成脂肪酸和甘油三酯的重要前体分子（Kastaniotis A J, et al. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids, 2017, 1862(1): 39
‑
48.），也是合成聚酮类化合物（Shimizu Y, et al. Chembiochem, 2017, 18(1): 50
‑
65.）和许多平台化合物（Kildegaard K R, et al. Microb Cell Fact, 2016, 15: 53.）的原材料。
[0003]一般而言，细胞内的辅酶A经乙酰辅酶A合成酶（acetyl
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CoA synthase, ACS）和乙酰辅酶A羧化酶（acetyl
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CoA carboxylase, ACC）的先后催化，形成丙二酰辅酶A（Qu Q, et al. Cell Death Dis, 2016, 7(5): e2226.）。丙二酰辅酶A在参与细胞反应并被消耗的同时，脱去羧基重新生成辅酶A（Waki T, et al. Nat Commun, 2020, 11(1): 870.）。因此，丙二酰辅酶A在细胞内处于一种动态平衡。由于丙二酰辅酶A的胞内含量低，分离和纯化难度较大，并且难以通过化学方法合成，导致其市场价格通常远高于其下游产品，因而制约了这一辅助因子在工业化生产中的广泛应用。
[0004]近年来，学者们尝试通过多种途径提高微生物细胞内丙二酰辅酶A的量，如通过提高细胞内乙酰辅酶A的含量（Krivoruchko A, et al. Metab Eng, 2015, 28: 28
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42.）或乙酰辅酶A羧化酶的表达水平（Wang J C, et al. Biosci Biotechnol Biochem, 2016, 80(6): 1214
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1222.）等手段促进丙二酰辅酶A的形成，同时限制丙二酰辅酶A流向与目标分子无关的通路（Yang D，et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(40): 9835
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9844.），从而提高目标分子的产量。然而，目前在体外合成体系中尚无类似策略降低因丙二酰辅酶A带来的高生产成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素酶促合成方法，该方法首先建立一种丙二酰辅酶A的再生体系，以显著降低了体外酶促合成柚皮素时因昂贵的丙二酰辅酶A所带来的高成本，该体系同样适应于其他需要以丙二酰辅酶A为底物的生化反应；同时构建一种高活性三功能酶，并通过优化体外反应条件显著提高了目标分子的产量和底物的总转化率。
[0006]本专利技术提供了一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，具体包括以下步骤：步骤1、克隆丙二酰辅酶A再生体系中关键酶基因从大肠杆菌中克隆ACS基因，构建重组质粒pET
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32a
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ACS，从毕赤酵母中克隆ACC1
基因，构建重组质粒pGAP
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Neo
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ACC1；步骤2、重组蛋白ACS和ACC1的诱导表达与纯化将重组质粒pET
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ACS转化感受态大肠杆菌，IPTG诱导表达、纯化，得到重组蛋白ACS；同时将重组质粒pGAP
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Neo
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ACC1转化毕赤酵母，经过表达和纯化，得到重组蛋白ACC1；步骤3、从头合成柚皮素的重组三功能酶的构建、表达与纯化利用重叠延伸PCR技术，将大豆的4
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香豆酰辅酶A连接酶基因4CL1和查尔酮异构酶基因CHI以及高粱的查尔酮合酶基因CHS2用柔性连接肽(GGGGS)2相连接，构建原核表达质粒pET
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32a
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SUMO
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4CL1
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(GGGGS)2‑
CHS2
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(GGGGS)2‑
CHI，将原核表达质粒pET
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SUMO
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4CL1
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(GGGGS)2‑
CHS2
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(GGGGS)2‑
CHI转化大肠杆菌，IPTG诱导表达、纯化，得到重组三功能酶；步骤4、建立基于丙二酰辅酶A再生的体外酶促合成体系基于丙二酰辅酶A再生的体外酶促合成体系至少包含Tris
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HCl、磷酸钾缓冲液、甘油、MgCl2、ATP、CoA、醋酸钠、NaHCO3、ACS、ACC1，并在该体系中加入用于合成柚皮素的重组三功能酶，然后在一定条件下反应得到反应产物。
[0007]本专利技术设计一种丙二酰辅酶A再生的反应体系，在构建乙酰辅酶A合成酶ACS基因与乙酰辅酶A羧化酶ACC1基因的重组表达质粒的基础上，将重组质粒分别转化大肠杆菌和酵母细胞，表达目的蛋白，并将纯化的ACS与ACC1重组蛋白加入柚皮素体外酶促合成体系中，实现了丙二酰辅酶A的再生，以及以4
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香豆酸为底物在体外低成本酶促合成柚皮素。本专利技术设计了一个新的反应体系，无需添加昂贵的丙二酰辅酶A便能对其进行再生利用，并最终生成柚皮素。该体系仅需添加低成本的无机盐、ATP和能够维持丙二酰辅酶A循环生成的辅酶A，反应产物单一，易于分离纯化，成本可控，使柚皮素体外合成在生产层面成为可能，同时为其他利用丙二酰辅酶A进行生产的方案提供新思路。
[0008]所述步骤1中，克隆ACS基因时，设计一对PCR引物：正向引物为5
’‑
GCTGATATCGGATCCGAATTCatgagccaaattcacaaacac
‑3’
，斜体碱基示酶切位点EcoRI；反向引物为5
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GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGttacgatggcatcgcgatag
‑3’
，斜体碱基示酶切位点XhoI；克隆ACC1基因时，设计一对PCR引物：正向引物为5
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CTATTTCGAAACGAGGAATTCATGAGCGAAGAAAGCTTATTC
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，斜体碱基示酶切位点EcoRI；反向引物为5
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TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCCTTTCAAAGTCTTCAACAATTTTTC
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，斜体碱基示酶切位点Not本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、从大肠杆菌中克隆ACS基因，构建重组质粒pET
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ACS，从毕赤酵母中克隆ACC1基因，构建重组质粒pGAP
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Neo
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ACC1；步骤2、将重组质粒pET
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ACS转化感受态大肠杆菌，IPTG诱导表达、纯化，得到重组蛋白ACS；同时将重组质粒pGAP
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Neo
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ACC1转化毕赤酵母，经过表达和纯化，得到重组蛋白ACC1；步骤3、将大豆的4
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香豆酰辅酶A连接酶基因4CL1和查尔酮异构酶基因CHI以及高粱的查尔酮合酶基因CHS2用柔性连接肽(GGGGS)2相连接，构建原核表达质粒pET
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SUMO
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4CL1
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(GGGGS)2‑
CHS2
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CHI，将原核表达质粒pET
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4CL1
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(GGGGS)2‑
CHS2
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(GGGGS)2‑
CHI转化大肠杆菌，IPTG诱导表达、纯化，得到重组三功能酶；步骤4、建立基于丙二酰辅酶A再生的体外酶促合成体系，该体系至少包含Tris
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HCl、磷酸钾缓冲液、甘油、MgCl2、ATP、CoA、醋酸钠、NaHCO3、ACS、ACC1、重组三功能酶，然后在一定条件下反应得到反应产物。2.根据权利要求1所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于：所述步骤3中，利用重叠延伸PCR技术将大豆的4
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香豆酰辅酶A连接酶基因4CL1和查尔酮异构酶基因CHI，高梁的查尔酮合酶基因CHS2克隆至原核表达载体pET
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SUMO，构建重组质粒pET
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4CL1
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CHS2
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CHI，将该重组质粒按常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达，利用镍柱亲和纯化获得重组三功能酶蛋白。3.根据权利要求2所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，构建重组质粒pET
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SUMO
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4CL1
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(GGGGS)2‑
CHS2
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(GGGGS)2‑
CHI过程中，克隆4CL1基因时，设计一对PCR引物：正向引物为5
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GAACAGATTGGTGGTGGATCCATGGCACCTTCTCCACAA
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；反向引物为5
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CGACCCACCTCCGCCCGACCCACCTCCGCCACTAGTATTGGCCACCACCAAACC
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【专利技术属性】
技术研发人员：张新跃，聂也森，何妍之，张智萍，丁笠，陈磊，廖凯，赵晨宏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：