乙酰CoA合成酶基因RKACS1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种乙酰CoA合成酶基因RKACS1，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；该基因是红冬胞酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离获得的乙酰CoA合成酶基因，将该基因转化到红冬孢酵母YM25235中，实验结果显示，乙酰CoA合成酶基因RKACS1的过表达能引起红冬孢酵母YM25235菌株中总类胡萝卜素和油脂含量的增加，本发明专利技术通过基因工程手段对微生物进行改造，来提高微生物体内类胡萝卜素和油脂的产量，为大规模商业化生产类胡萝卜素和油脂奠定基础。生产类胡萝卜素和油脂奠定基础。生产类胡萝卜素和油脂奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
乙酰CoA合成酶基因RKACS1及其应用


[0001]本专利技术属于生物和遗传工程
，涉及一种乙酰CoA合成酶基因RKACS1，具体涉及从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中克隆的乙酰CoA合成酶基因RKACS1以及将该基因与载体连接，转入酵母细胞中提高该基因的表达水平并促进类胡萝卜素和油脂的合成。

技术介绍

[0002]类胡萝卜素（carotenoids）是自然界中广泛存在的一类天然色素，一般呈现黄色、红色或橙红色，目前在高等植物、动物、真菌等生物体中已发现的天然类胡萝卜素有800多种，常见的蔬菜水果中均存在丰富的类胡萝卜素，如柑橘、芒果、南瓜等。大部分类胡萝卜素是一类由8个首尾相连的类异戊二烯组成的C
40
类萜化合物及其衍生物，有些类胡萝卜素含C
45
或C
50
骨架，被称为高类胡萝卜素，也有少部分碳骨架少于C
40
的类胡萝卜素，被称为脱辅基类胡萝卜素；所有的类胡萝卜素均含有聚异戊二烯结构。
[0003]依据类胡萝卜素化学结构的组成可将类胡萝卜素分为胡萝卜素(carotene)和叶黄素(xanthophyll)两大类，其中，胡萝卜素是只含C、H两种元素的α
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胡萝卜素、β
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胡萝卜素、γ
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胡萝卜素和番茄红素等；叶黄素是一类氧化后的胡萝卜素，含有C、H、O三大元素，可形成羟基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能团，如叶黄素、玉米黄质、虾青素等；含氧基团使类胡萝卜素分子结构发生复杂多样的变化，极性的改变使类胡萝卜素易于与机体脂肪酸、糖和蛋白等结合，形成多种功能不同的活性分子。类胡萝卜素具有较强的吸光性，通常在波长430~570nm之间有吸收峰，目前普遍采用反相高效液相色谱法，配合紫外可见光检测器、质谱、核磁共振或二极管阵列检测器对样品中的类胡萝卜素进行定性定量分析。
[0004]类胡萝卜素在人类的营养与健康领域起着十分重要的作用，α
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胡萝卜素、β
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胡萝卜素、γ
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胡萝卜素和β
‑
隐黄素等可以在双加氧酶的作用下形成维生素A，它们因此被称为维生素A原活性物质，是维生素A的主要来源。作为人体必需的微量营养素，类胡萝卜素具有多种功能，如抗氧化、抑制并消除体内的自由基、减慢衰老等。医学研究表明，除以上功能外，类胡萝卜素还具有抗癌、预防眼底黄斑病变和白内障、预防心血管疾病、预防非酒精性脂肪肝、加强机体免疫力等功能。此外，类胡萝卜素还能与动物蛋白相结合，使生物体呈现出体色，具有一定的保护作用。目前类胡萝卜素已被联合国粮食与农业组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）等国际组织定为A类营养素，已在50多个国家获批为营养、色素双重功用的食品添加剂，被广泛应用于医药、食品、保健、美容等行业。迄今为止，已见报道的类胡萝卜素的生产工艺包括天然提取法、化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵生产类胡萝卜素具有生物活性高、生产过程易于处理、产品安全和生产周期短等优点，近年来受到广泛关注。尽管已经有很多策略用来促进微生物中类胡萝卜素的合成，但是由于成本效益、色素产量和分离提取等方面的技术问题的限制，应用传统微生物发酵技术来生产各种不同类胡萝卜素在工业生产方面仍缺乏相应的策略。因此我们希望可以从生物工程角度着手，利用基因技术、物种发现、杂交培育等技术，得到高含量的原料，从而缓解目前天然类胡萝卜素的
生产发展局限。近年来，结合经典遗传学和现代分子生物学方法来优化菌株原有的代谢途径和调节网络或者组装异源代谢途径使微生物高效益、低成本生产类胡萝卜素的代谢工程提供了一种潜在的替代途径。
[0005]油脂（lipids）是生物体进行多项生命活动的关键物质，常见的油脂包括亚油酸（LA）、α
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亚麻酸（ALA）、γ
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亚麻酸（GLA）、花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）以及二十二碳六烯酸（DHA）等功能性油脂。研究表明，ALA、DHA、EPA等ω
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3脂肪酸作为人体重要的生命活性物质能有效促进人体生长发育，具有预防糖尿病、心脑血管疾病、抗癌、抗炎、降血脂、增强机体免疫力等生理功能，长期缺乏ω
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3脂肪酸与ω
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6脂肪酸易导致遗传性肥胖、机体代谢紊乱，进而影响人体健康；此外，LA、ARA、DHA等可作为药物添加剂，起到降低血糖血压、阻止妊娠、缓解呼吸道疫病、预防动脉硬化及消化系统溃疡的作用。功能性油脂大多是人体必需而又无法自身合成的，ALA可从部分植物油中获得，DHA和EPA主要来源于鱼油和微生物油脂。但鱼油成本高、易受污染、品质不稳定、产量难以满足全球需求。
[0006]产油微生物的油脂含量高，其脂肪酸组成与植物油脂相似。与植物油脂相比，产油脂微生物具有不与粮争地、不受气候和环境影响、生长周期短、容易实现大规模生产等优势，因此利用微生物发酵生产油脂越来越受到关注。目前，已有30多种酵母被鉴定为产油酵母，这些产油酵母大多能通过在特定条件下培养或基因改造来提高细胞内油脂的积累量。因此我们希望可以从生物工程角度着手，利用基因技术、合成生物学等技术，有目的的改造菌株，提高现有菌株的油脂转化率，从而缓解目前油脂资源紧张的压力。近年来，结合经典遗传学和现代分子生物学方法来优化菌株原有的代谢途径和调节网络或者组装异源代谢途径为微生物高效益、低成本生产油脂的代谢工程提供了一种潜在的替代途径。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种乙酰CoA合成酶基因RKACS1，该基因从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或为该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1977bp（碱基），编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽或片段。
[0008]本专利技术另一目的是提供乙酰CoA合成酶基因RKACS1的重组表达载体，是将SEQ ID NO:1所示基因直接与不同表达载体（质粒、病毒或运载体）连接所构建的重组载体。可用本领域技术人员熟知的方法来构建乙酰CoA合成酶基因RKACS1的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体；这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等；所述乙酰CoA合成酶基因RKACS1的核苷酸序列可有效连接到表达载体的恰当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子；表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等；在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强；增强子是DNA表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙酰CoA合成酶基因RKACS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述的乙酰CoA合成酶基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琦，邹玲，陈波，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：