本发明专利技术公开了一种天麻谷氨酰胺合成酶（GS）基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码342个氨基酸残基；构建天麻GS基因的原核表达载体，原核表达分析表明本发明专利技术天麻谷氨酰胺合成酶基因为可溶性蛋白，其分子量约为59.94kDa；本发明专利技术构建了天麻谷氨酰胺合成酶基因的真核过表达载体，通过农杆菌法转染天麻共生菌蜜环菌，获得转天麻谷氨酰胺合成酶基因的蜜环菌，将转GS基因工程蜜环菌在13℃和28℃下培养，长势比野生型蜜环菌好且生长快速，因此本发明专利技术天麻谷氨酰胺合成酶基因有助于缩短蜜环菌的培养时间和提高蜜环菌的抗寒性和抗高温生长，本发明专利技术为增强天麻的抗冷性，扩大天麻种植分布范围，增强天麻氮代谢能力及提高天麻产量提供实验基础。产量提供实验基础。产量提供实验基础。
【技术实现步骤摘要】
一种天麻谷氨酰胺合成酶基因及其应用
[0001]本专利技术属于分子生物学及基因工程相关
，涉及一种天麻中谷氨酰胺合成酶基因以及在提高天麻抗寒性中的应用。
技术介绍
[0002]天麻（Gastrodia elata）是与蜜环菌共生的异养多年生草本植物，分布于全国大部分地区；其干燥块茎亦称天麻，是一味常用而较名贵的中药，临床多用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等症，天麻的经济药用价值都非常高，而且市场需求量大。天麻过去一直依赖野生资源，自从上个世纪70年代野生变人工种植成功后，人工种植天麻成为主要商品来源。天麻种子萌发不同于其他一般植物，不仅需要适宜的环境条件，而且还需要萌发菌为其提供营养物质才能萌发，当天麻种子萌发形成原球茎后，原球茎从共生菌
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蜜环菌(Arimillia mellea)中吸取营养，发育形成白麻又称白头麻，总的看来，天麻整个生活周期中所需要的营养，主要是依靠消化侵入其体内的真菌菌丝来取得，然后白头麻换头生长发育形成箭麻。天麻可进行无性繁殖栽培和有性繁殖栽培，天麻无性繁殖常用健壮无病虫害白麻作麻种。影响天麻生长发育的因素有很多，如环境、温度、土壤、采收等，其中温度是影响天麻生长的关键因子；天麻对温度很敏感，当温度过高或过低，都会抑制天麻的生长；天麻生长最适宜温度为 20~25℃；在
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4℃以下时天麻易受到冻害死亡而丧失繁殖能力，温度在
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4~10℃时则天麻停止生长进入低温休眠期；当土温上升至12~14℃时，天麻的地下块茎开始萌动生长；当温度上升至20℃时，天麻进入迅速生长期，但温度超过30℃时天麻的生长会受到抑制，从而影响产量。
[0003]蜜环菌是一种以腐生为主的兼寄生真菌，主要寄生于阔叶树的根、茎和叶，分解有机物质如纤维素、半纤维素、木质素的能力强。蜜环菌是促进天麻生长发育的重要菌根真菌，蜜环菌菌株的不同对天麻的产量有较大影响，蜜环菌的索粗壮发达程度、生长情况、生长速度决定天麻产量高低，因此优质蜜环菌是天麻高产的关键。无杂菌污染、生长旺盛、有绿色荧光及蕈香气味的蜜环菌可使天麻高产。蜜环菌对温度也很敏感，蜜环菌在 6~8℃时开始生长，生长最适温度为 24℃，超过 30℃就停止生长。
[0004]转录组是特定类型的细胞、组织、器官或发育阶段的细胞群内转录出来的所有 RNA 的总和，主要包括 mRNA 和非编码 RNA。处于不同生长期不同环境条件下不同组织的基因表达情况是不同的，因此可用转录组的方法挖掘特定生理功能基因。由于植物对低温的耐受性不同，低温胁迫程度不同，植物表现出不同的响应。已有研究表明植物响应低温胁迫下转录组测序得到的差异表达基因主要集中在氨基酸代谢、脂质代谢、糖酵解、植物激素合成与转导、抗氧化系统和次生代谢产物合成等通路。通过转录组分析，可以获得与低温胁迫相关的差异表达基因，为抗寒性基因功能研究提供候选基因，也为进一步研究植物抗寒性分子机制以及抗寒品种选育提供基础。
技术实现思路
[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术以不同温度下生长的昭通乌天麻（Gastrodia elata）为研究对象，利用转录组数据组装后得到163261356个 Clean reads 片段，共有 59501个 Unigene 被注释，KEGG 信号通路分析发现，在所有途径中，富集基因最多的是碳代谢途径，其次是翻译、脂质代谢和植物激素信号传导；说明代谢途径、次生代谢产物合成、RNA 转运、脂质代谢等的差异基因表达与不同温度下天麻的生长发育的作用机制有关。从转录组数据里筛选出与代谢途径相关的关键基因
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谷氨酰胺合成酶基因。对差异表达基因谷氨酰胺合成酶基因进行克隆与功能鉴定；获得一种天麻谷氨酰胺合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，本专利技术天麻谷氨酰胺合成酶基因全长1062bp。
[0006]本专利技术另一目的是将上述天麻谷氨酰胺合成酶基因应用在提高天麻共生菌蜜环菌抗寒性中。
[0007]为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术的技术方案如下：1、蜜环菌AM02活化（实验室自己分离，保存于实验室冷库中），具体步骤为
①
将蜜环菌菌索取出置于PDA平板（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，ddH2O 1L，pH自然，115℃灭菌20min）上，25℃培养6天；
②
待PDA培养基上长出白色幼嫩菌索后，将幼嫩菌索边缘的白色菌丝用针头挑于新PDA培养基（马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、ddH2O 1L、pH5.5，115℃灭菌20min）培养，此步可重复；
③
至从中央向外缘长出白色菌丝后，挑取边缘的菌丝于液体完全培养基（葡萄糖46g、酵母膏5g、蛋白胨13g、硫酸镁2g、磷酸二氢钾1g、ddH2O 1L，pH 6.5，115℃灭菌20min）中 25℃、150 rpm下避光培养 10d，长出菌球备用；蜜环菌菌材的制备，步骤具体如下：
①
选质地坚硬、耐腐蚀的阔叶树进行蜜环菌菌材的培养；
②
将选用的苹果树锯成小段，放清水中浸泡一夜，清洗干净后置于培养瓶中，121℃下灭菌20min ，灭菌3次以上，以防止木材中的杂菌污染蜜环菌；
③
将蜜环菌用FRH
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2A 破碎机（金坛市白塔新宝仪器厂产）破碎后倒入灭好菌的木材中，待蜜环菌缠于木材上长出菌索后，说明菌材制备成功备用；2、本专利技术从云南昭通采集新鲜白头麻（连土一起采回，短暂存于4℃冷库），将从昭通采集回来的置于4℃冷库的第二年生的天麻（白头麻）从土壤里挖出来，用流水清洗天麻块茎表面的泥土残渍，将块茎放75%乙醇中处理3min，无菌水冲去残留的乙醇，再置于2.5% NaClO溶液中浸泡10min，无菌水冲去残留的NaClO溶液，用超纯水洗干净并置于灭菌水中洗2
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3次，将洗净的白头麻表面水分吸干后，接种于蜜环菌菌材上；分别在4℃冷库、13℃恒温箱（箭麻生长的临界温度）和 23℃培养室（正常生长温度）黑暗培养条件下培养，然后蜜环菌菌索开始侵染昭通乌天麻，给白头麻（母麻）提供营养，使其发育形成箭麻（商品麻），第6d 观察得到23℃下箭麻开始生长，第40d 观察到13℃下箭麻开始生长， 第50d观察4℃下天麻不发芽；天麻培养至50d 时采集不同温度下生长的天麻样品；将13℃母麻、23℃商品麻和 23℃母麻送公司进行转录组测序，从转录组中筛选log2(变化倍数)>2的差异表达基因GS基因；因此取13℃下培养的母麻，采用Trizol Reagent（Invitrogen）法提取天麻的总RNA，RNA反转录获得cDNA，以cDNA为模板，采用巢式PCR引物，进行两次巢式PCR，获得500bp以内的未知片段，胶回收后连接到pMD
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18T 载体上，转入大肠杆菌DH5α中，测序；将测序结果与靠近
已知序列的3
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种天麻谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2....
【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，钱澄，仇全雷，周春艳，年洪娟，
申请(专利权)人：西藏波密高原藏天麻产业开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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