一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗是通过构建非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，并经293TD37细胞包装而获得。其中，非洲猪瘟病毒的四种抗原基因分别为L8Lubiqutin、I215L、I73Rhbsag和E146L。非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建，主要通过CRISPR/cas9敲除腺病毒载体的E1、E3、E2a和E4基因，构建了E1、E4区域的穿梭质粒，分别用于表达L8Lubiqutin和I215L、I73Rhbsag和E146L基因，从而获得全新的腺病毒载体。该载体相对于第一代腺病毒载体，增加了约3kb的载体容量，再通过293TD37细胞系进行包装，获得滴度较高的重组腺病毒，用于制作非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗。本发明专利技术可以极大地提高腺病毒载体疫苗的容量，使用在一个腺病毒载体上同时表达非洲猪瘟四个独立抗原的方式，增强对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
[0001]本申请主张中国在先申请,申请号:2020106427557，申请日2020年7月6日的优先权；其所有的内容作为本专利技术的一部分。


[0002]本专利技术涉及基因工程
和免疫学领域，具体而言，涉及一种非洲猪瘟病毒的重组腺病毒疫苗及其构建方法。

技术介绍

[0003]非洲猪瘟(ASF)是一种具有高度传染性的猪病毒病。在家猪中可导致接近100％的高死亡率。ASF是由ASF病毒(ASFVirus,ASFV)引起，ASFV是一种较大的双链DNA病毒,主要在巨噬细胞的细胞质中复制，具有20面体结构，直径为175～215nm,基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。构成ASFV病毒粒子的结构蛋白有P30、P72、P49、P54、P220、P62、pB602L、CD2v蛋白等，基于一个或两个亚单位疫苗迄今未能诱导免疫强大到足以对疫苗接种者具有显著保护作用。
[0004]我国已于2018年发现ASF疫情，带来了巨大的直接和间接经济损失。因此，迫切需要开发针对ASFV的疫苗。有报道，ASFV疫苗的先前的研究主要集中灭活疫苗和减毒疫苗。然而，灭活疫苗不能诱导有效的保护性应答；减毒疫苗的生物安全是其使用的主要限制因素，减毒毒株在我国是不允许研究的。然而在现阶段不能进行活病毒实验的情况下，需要提供疫苗以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。
[0005]因此需要开发新型的ASFV疫苗。潜在的候选疫苗是活载体疫苗。与其他疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在：(1)能主动感染靶组织或细胞，提高了外源基因进入细胞的效率；(2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子的产生；(3)多数能诱导长期的免疫应答。有利的是，需要用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质。
[0006]活载体疫苗是指将病原体的蛋白质编码基因克隆到活病毒载体，然后用于免疫动物，在动物体内表达所述蛋白质，从而诱导针对所述蛋白质的免疫应答。腺病毒5型作为表达非洲猪瘟抗原蛋白的载体具有很多优势：
①
腺病毒表达载体是复制缺陷型的，只能在其独特的互补细胞系中生产制备，同时腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低，制备疫苗安全性好；
②
重组的腺病毒载体可获得较高的滴度，利于大规模生产，工厂化效率高，生产成本低；
③
目前对腺病毒5型的结构、特性、功能的研究较为深入，腺病毒载体容易复制，操作简单，利于研究；
④
普通的一代腺病毒载体基因组敲除了6K的基因，能插入外源基因7.5k，具有较大的容量；
⑤
腺病毒相对稳定，经得起纯化、浓缩、保存。
[0007]现有技术报道了一些活载体疫苗。例如将ASFV p32、p54、p72和pp62基因分别重组入人腺病毒Ad5载体中进行“鸡尾酒”式免疫,获得了良好的抗原特异性CTL反应；之后他们又将ASFV A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L和K205R
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A104R共7个ASFV抗原基因,重组入复制缺陷型腺病毒载体,通过“鸡尾酒”式混合免疫后能够诱导强烈体液免疫反应和细
ID NO.7所示的核苷酸序列。
[0016]非洲猪瘟病毒的抗原基因共计有160多种，专利技术人经过大量筛选实验，从中选出了20种免疫效果更强的抗原基因，分别为：P72、B602L、P30、P54、CP129R、MGF5L6L、CP312R、MGF110
‑
4L、L8L、I215L、I73R、E146L、EP402R、EP153R、I177L、K205R、F317L、A151R、P34、pp62；这20种抗原基因根据基因片段大小，被分成五组，每组的4种抗原基因能在本专利技术提供的重组腺病毒载体pAd5LCL3中得以共表达，即能在同一载体中完全独立表达四种抗原基因。这五组抗原基因疫苗(包括了5个重组腺病毒载体pAd5LCL3)组成了完整的非洲猪瘟病毒疫苗，取得了非常好的免疫效果。本专利技术选取了L8L、I215L、I73R、E146L、EP402R四种抗原基因，可以很好地搭配组装在同一重组腺病毒载体中，从而得以完全独立表达这四种抗原基因。
[0017]研究证明，表E3区对于外源蛋白的表达水平不高，而在E1和E4区进行抗原基因的表达，表达水平更高，因此可以将四个抗原分别表达在E1区和E4区。
[0018]E3基因由于跟复制相关，需要敲除，让其复制缺陷；E3的作用是与腺病毒的免疫逃逸相关；敲除E3区可以增加腺病毒载体的容量；并使腺病毒载体能够正常包装。
[0019]另一方面，本专利技术还提供一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，包含以下步骤：
[0020]1)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5。
[0021]2)再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E4基因，使用PCR扩增并引入I
‑
sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4。
[0022]在已经敲除了E1、E3基因的基础上，敲除E4基因，能提高腺病毒载体的容量，降低其免疫原性，同时可以在E4区域插入外源基因，外源基因可以在E4位置大量表达，而不影响腺病载体的包装。在E1、E4基因处表达外源基因，能避免多个外源基因在同一区域表达的相互干扰，更利于表达，同时减少了不必要的E4相关基因，降低了腺病毒的免疫原性，使腺病毒能较为长期得存在于宿主细胞中，使外源基因更长期表达。
[0023]E4区基因在免疫原性中起着关键作用，大量E4区域基因的表达会使宿主产生较为强烈的免疫反应，诱导抗体的产生，不利于是腺病毒载体在宿主中长期表达目的蛋白，因此在E4区域敲除不必要的基因可以降低腺病毒载体的免疫原性，使载体能够在较长时间内进行表达。
[0024]为了使E4基因能敲除完全，便于大载体质粒的连接，使用CRISPR/cas9方法将E4区域的上游Fiber基因、以及E4的基因，进行敲除，使用PCR的方法扩增部分fiber以及引入I
‑
sceI单酶切位点，再使用Gibson的无缝克隆方法，将多余切除的片段连接至载体上，重新获得E4敲除引进了I
‑
sceI单酶切位点的载体质粒。使用I
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sceI将载体质粒线性化，构建E4区域的穿梭质粒，使外源基因重组到E4区域，并在E4区域大量表达。
[0025]3)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；所述四种抗原基因分别为L8Lubiqutin、I215L、I73Rhbsag和E146L，其中L8Lubiqutin是在L8L上添加分子佐剂ubiqutin获得，I73Rhbsag是在173R上添加分子佐剂hbsag获得，L8Lubiqutin和I215L表达在E1区，I73Rhbsag和E146L表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3
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L8Lubiqutin
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I215L
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I73Rhbsag
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E146L；其中，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3
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L8Lubiqutin
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I215L
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I73Rhbsag
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E146L需通过由pcDNA3.1+(hyg)
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ORF6
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IRES
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DBP构建的293TD37细胞实现重组腺病毒包装，293TD37细胞的细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心；其中，L8L、ubiqutin、I215L、I73R、hbsag、E146L、pAd5LCL3分别具有如序列表中Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.6、Seq ID NO.7所示的核苷酸序列。2.一种权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：1）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5；2）再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5的E4基因，使用PCR扩增并引入I
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sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5
△
E4；3）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5
△
E4的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3；4）构建腺病毒E1区域穿梭质粒pS5E1，通过DNA连接酶分别与L8Lubiqutin、IRES、I215L基因片段连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1
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L8Lubiqutin
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IRES
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I215L；5）构建腺病毒E4区域穿梭质粒pS5E4
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EGFP，I73Rhbsag、2A、E146L基因通过融合PCR技术得到I73Rhbsag
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2A
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E146L基因片段，通过对穿梭质粒pS5E4
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EGFP酶切，敲除EGFP，并通过DNA连接酶与I73Rhbsag
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2A
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E146L连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4
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I73Rhbsag
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2A
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E146L；6）将穿梭质粒pS5E1
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L8Lubiqutin
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IRES
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I215L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，得到腺病毒载体质粒pAd5LCL3
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L8Lubiqutin
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IRES
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I215L；7）将穿梭质粒pS5E4
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I73Rhbsag
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2A
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E146L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3
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L8Lubiqutin
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IRES
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I215L同源重组，获得四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3
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L8Lubiqutin
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I215L
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I73Rhbsag
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E146L，pAd5LCL3
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L8Lubiqutin
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I215L
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I73Rhbsag
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E146L具有如序列表中Seq ID NO.8所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的腺病毒环状载体质粒来源于在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娜，陈平，张婷婷，钟鑫涛，张风苹，张利娟，祝志刚，王暄，李娅芳，李楠，
申请(专利权)人：嘉兴安宇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：