一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗是通过构建非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，并经293TD37细胞包装而获得。其中，非洲猪瘟病毒的四种抗原基因分别为P72、B602L、P30和P54。非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建，主要通过CRISPR/cas9敲除腺病毒载体的E1、E3、E2a和E4基因，构建了E1、E4区域的穿梭质粒，分别用于表达P72和B602L、P30和P54基因，从而获得全新的腺病毒载体。该载体相对于第一代腺病毒载体，增加了约3kb的载体容量，再通过293TD37细胞系进行包装，获得滴度较高的重组腺病毒，用于制作非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗。本发明专利技术可以极大地提高腺病毒载体疫苗的容量，使用在一个腺病毒载体上同时表达非洲猪瘟四个独立抗原的方式，增强对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。应。应。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
[0001]本申请主张中国在先申请,申请号:2020106427453，申请日2020年7月6日的优先权；其所有的内容作为本专利技术的一部分。


[0002]本专利技术涉及基因工程
和免疫学领域，具体而言，涉及一种非洲猪瘟病毒的重组腺病毒疫苗及其构建方法。

技术介绍

[0003]非洲猪瘟(ASF)是一种具有高度传染性的猪病毒病。在家猪中可导致接近100％的高死亡率。ASF是由ASF病毒(ASFVirus,ASFV)引起，ASFV是一种较大的双链DNA病毒,主要在巨噬细胞的细胞质中复制，具有20面体结构，直径为175～215nm,基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。构成ASFV病毒粒子的结构蛋白有P30、P72、P49、P54、P220、P62、pB602L、CD2v蛋白等，基于一个或两个亚单位疫苗迄今未能诱导免疫强大到足以对疫苗接种者具有显著保护作用。
[0004]我国已于2018年发现ASF疫情，带来了巨大的直接和间接经济损失。因此，迫切需要开发针对ASFV的疫苗。有报道，ASFV疫苗的先前的研究主要集中灭活疫苗和减毒疫苗。然而，灭活疫苗不能诱导有效的保护性应答；减毒疫苗的生物安全是其使用的主要限制因素，减毒毒株在我国是不允许研究的。然而在现阶段不能进行活病毒实验的情况下，需要提供疫苗以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。
[0005]因此需要开发新型的ASFV疫苗。潜在的候选疫苗是活载体疫苗。与其他疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在：(1)能主动感染靶组织或细胞，提高了外源基因进入细胞的效率；(2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子的产生；(3)多数能诱导长期的免疫应答。有利的是，需要用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质。
[0006]活载体疫苗是指将病原体的蛋白质编码基因克隆到活病毒载体，然后用于免疫动物，在动物体内表达所述蛋白质，从而诱导针对所述蛋白质的免疫应答。腺病毒5型作为表达非洲猪瘟抗原蛋白的载体具有很多优势：
①
腺病毒表达载体是复制缺陷型的，只能在其独特的互补细胞系中生产制备，同时腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低，制备疫苗安全性好；
②
重组的腺病毒载体可获得较高的滴度，利于大规模生产，工厂化效率高，生产成本低；
③
目前对腺病毒5型的结构、特性、功能的研究较为深入，腺病毒载体容易复制，操作简单，利于研究；
④
普通的一代腺病毒载体基因组敲除了6K的基因，能插入外源基因7.5k，具有较大的容量；
⑤
腺病毒相对稳定，经得起纯化、浓缩、保存。
[0007]现有技术报道了一些活载体疫苗。例如将ASFV p32、p54、p72和pp62基因分别重组入人腺病毒Ad5载体中进行“鸡尾酒”式免疫,获得了良好的抗原特异性CTL反应；之后他们又将ASFV A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L和K205R
‑
A104R共7个ASFV抗原基因,重组入复制缺陷型腺病毒载体,通过“鸡尾酒”式混合免疫后能够诱导强烈体液免疫反应和细
胞免疫应答。但“鸡尾酒”式免疫，每个ASFV抗原基因都必须重组入一个复制缺陷型腺病毒载体，因此需要的载体数量非常多，有在免疫过程中受到针对腺病毒载体的免疫反应的风险。CN108504686A和CN108504687A分别提供了表达ASFV的EP153R和EP402R基因的重组腺病毒载体。CN109652449A公开了EP153R与EP402R两种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，CN109735567A公开了EP153R与P54两种抗原基因共表达的重组腺病毒载体。
[0008]但为了进一步增强对ASF的特异性免疫反应，还需进一步提高腺病毒载体的抗原基因容量，需用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质，以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。
[0009]CN110269932A公开了将ASFV的A104R、A151R、B119L、B602L、CD2v、K205R、P49等5
‑
7种抗原基因基于腺病毒载体融合在一起用于制备活载体疫苗。但多个抗原基因融合存在降低免疫原性和可能导致免疫失效的风险，因此要提高疫苗活性，还是必须要在每一个腺病毒载体上表达完全独立的抗原基因。
[0010]ASFV的P30蛋白是一种很重要的结构蛋白，由CP204L基因编码。研究发现P30能够诱导宿主细胞产生抑制细胞内化的中和抗体，从而使得疾病发作延迟甚至保护细胞抵抗病毒感染，因此P30在阻断病毒与细胞相互作用中有着重要的作用。P30作为病毒的早期蛋白，感染细胞后主要分布于细胞质中，在感染后4小时即可在胞浆内检测到；P30也是最具有抗原性的ASFV蛋白之一，有很强的免疫原性，在感染动物体内能诱导机体产生病毒中和抗体，因此通常被用做诊断抗原。ASFV的P54蛋白，由E183L基因编码，其抗体具有一定的病毒中和能力，此外，P30蛋白和P54蛋白与易感细胞上的两个不同的受体或结合位点相互作用，能缓和病程。P72蛋白是ASFV的主要检测抗原之一，大小约75ku。稳定性好，变异小。以P72蛋白为抗原，已经研发出一系列检测产品。由B602L基因编码的pB602L蛋白，可刺激基体产生较高水平的抗体。但目前现有技术中还没有四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，也没有关于ASFV的P72、B602L、P30、P54四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体并运用于活载体疫苗的开发。

技术实现思路

[0011]为解决上述问题，本专利技术提供一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；所述四种抗原基因分别为P72、B602L、P30和P54，其中P72和B602L表达在E1区，P30和P54表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3
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P72
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B602L
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P30
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P54。
[0012]非洲猪瘟病毒的抗原基因共计有160多种，专利技术人经过大量筛选实验，从中选出了20种免疫效果更强的抗原基因，分别为：P72、B602L、P30、P54、CP129R、MGF5L6L、CP312R、MGF110
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4L、L8L、I215L、I73R、E146L、EP402R、EP153R、I177L、K205R、F317L、A151R、P34、pp62；这20种抗原基因根据基因片段大小和蛋白结构，被分成五组，每组的4种抗原基因能在本专利技术提供的重组腺病毒载体pAd5LCL3中得以共表达，即能在同一载体中完全独立表达四种抗原基因。这五组抗原基因疫苗(包括了5个重组腺病毒载体pAd5LC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
origin、amp基本元素，Ad5左臂ITR部分序列，右臂PIX、PIVa2部分序列，以及CMV
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MCS SV40 early polyA；步骤5)所述的E4区域穿梭质粒pS5E4
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EGFP的骨架采用puc origin、amp基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列，右臂部分fiber基因序列，以及EF1α
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EGFP
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HBV polyA基因；其中puc origin、amp基本元素具有如序列表可见中Seq ID NO.10所示的核苷酸序列，EF1α
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EGFP
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HBV polyA基因具有如序列表可见中Seq ID NO.11所示的核苷酸序列。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤6)穿梭质粒pS5E1
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P72
‑
IRES
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B602L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，是通过PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1
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P72
‑
IRES
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B602L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra
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Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤7)穿梭质粒pS5E4
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P30
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2A
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P54与腺病毒载体质粒pAd5LCL3
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P72
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IRES
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B602L同源重组，是通过PacI和I
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sceI对穿梭质粒pS5E4
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P30
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2A
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P54和腺病毒载体质粒pAd5LCL3
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P72
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IRES
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B602L进行酶切，酶切产物去磷酸化，OM...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈平，李娜，张婷婷，钟鑫涛，祝志刚，张利娟，李娅芳，李楠，
申请(专利权)人：嘉兴安宇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：