一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法，涉及分子生物学和细胞生物学技术领域。本发明专利技术方法利用噬菌体文库展示、同源重组和细胞培养等技术，通过羊驼抗体天然文库进行多次淘选、验证和鉴定获得针对肿瘤抗原的VHH序列，进行质粒重组构建表达于人T细胞株Jurkat细胞快速验证该CAR是否有效，最后使用T细胞株Hut78细胞再次确认效果。本发明专利技术方法具有筛选速度快、低成本的特点，可快速筛选并评估出抗原受体CAR是否可以用于后续实验。CAR是否可以用于后续实验。CAR是否可以用于后续实验。

【技术实现步骤摘要】
一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学和细胞生物学
，尤其涉及一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法。

技术介绍

[0002]CAR
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T，全称是Chimeric Antigen Receptor T
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Cell Immunotherapy，指的是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。2017年8月3日，FDA批准诺华(Novartis)的CAR
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T疗法Kymriah(CTL
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019)上市，用于治疗复发性或难治性儿童、青少年B细胞急性淋巴白血病。2017年10月18日，FDA批准凯特(Kite)的CAR
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T疗法Yescarta(KTE
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C10)，用于治疗复发性或难治性的特定类型成人大B细胞淋巴瘤。正如所有的技术一样，CAR
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T技术也经历一个漫长的演化过程，正是在这一系列的演化过程中，CAR
‑/>T技术逐渐走向成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将抗原过夜包被于免疫管，封闭后加入羊驼噬菌体天然文库结合抗原，PBST清洗未结合的噬菌体后，使用胰酶洗脱已结合的噬菌体后加入AEBSF终止洗脱，获得噬菌体洗脱文库；(2)将步骤(1)中的噬菌体洗脱文库感染SS320进行扩增和保种细菌文库后，使用辅助噬菌体感染包装扩增噬菌体并纯化，获得噬菌体文库；(3)用步骤(2)得到的噬菌体文库重复步骤(1)
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(2)的过程2
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3次，获得噬菌体洗脱文库；(4)将步骤(3)得到的噬菌体洗脱文库感染SS320后涂板，挑取预设数量的单克隆培养，加入辅助噬菌体进行噬菌体表达，进行ELISA检测，挑取阳性孔对应的单克隆再次进行ELISA验证，保留最终的阳性单克隆；(5)将步骤(4)最终获得的阳性单克隆进行培养、扩增、保种并测序；(6)将步骤(5)中经测序确认无误的羊驼纳米抗体序列插入具有CAR结构的病毒核心载体中构建重组质粒，转化感受态细胞获取单克隆、保种和测序鉴定；(7)将步骤(6)中获得的CAR重组质粒电转Jurkat细胞表达CAR后，Jurkat细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养18h，使用抗人CD69流式抗体检测Jurkat细胞的CD69表达和MFI差值；(8)将步骤(7)中有效激活的CAR重组质粒进行病毒包装浓缩，感染Hut78细胞表达CAR后，Hut78细胞与靶细胞共培养48h，使用7
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AAD流式抗体检测靶细胞的死亡率；(9)若杀伤能力高于对照组且具有显著性差异，则判定该嵌合抗原受体CAR可用于后续实验。2.如权利要求1所述的应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作包括：1)将抗原包被于免疫管，包被液为CBS，pH9.6，于4℃孵育16
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20h；去上清，室温下用2ml PBS清洗3次；加入2ml封闭液，室温旋转孵育2h；去上清，室温下用2ml PBS清洗3次；2)对1)的产物离心去上清，加入2ml PBS、羊驼噬菌体天然文库0.05ml，效价大于等于10
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pfu/ml，室温下旋转1h；去上清，用2ml PBST缓冲液室温清洗免疫管20次；去上清，加入1ml 0.25mg/ml Trypsin溶液，室温旋转洗脱30min；加入10μl 10％AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的EP管中，即获得噬菌体洗脱文库。3.如权利要求1所述的应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作包括：1)取1.8ml菌种复苏SS320，加入2xYT进行培养至菌液的OD600＝0.250；加入步骤(3)得到的噬菌体洗脱文库500μl至2ml菌液中，37℃，220rpm，30min；将全部菌液均匀涂布到1个T150 2xYT平板中，吹干，37℃培养16
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20h；取出平板，加入6ml 2
×
YT，刮下菌落并将菌液收集至15ml离心管中，即为扩增后的细菌子文库，检测冻存前OD600，冻存体积为X ml＝10/OD600；2)将细菌子文库菌液X ml加入至100ml 2
×
YT液体培养基中，X＝10/OD600，37℃，220rpm培养直至OD600＝0.250；加入辅助噬菌体MOI＝10：1，37℃，220rpm继续培养30min；
加入终浓度为50μg/ml的Kana和终浓度为0.2mM的IPTG，30℃，220rpm过夜培养；3)收集培养后的菌液50ml至离心管中离心2000g，10min，收集上清；加入1/4体积预冷的PEG/NaCl溶液，混匀，冰浴30min；4℃离心2000g，20min，弃上清，纸上倒置2min；加入1ml PBS重悬沉淀至...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶健斌，蔡冠星，汤赞，曾桂芳，陈洁莹，蔡车国，胡隽源，
申请(专利权)人：深圳市北科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：