高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，针对目前利什曼病的现状公开了一种高效表达利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的人复制缺陷型重组腺病毒载体。具体为将修饰后的PEPCK基因与pShuttle

【技术实现步骤摘要】
高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体


[0001]本专利技术属于生物
，具体为一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体。

技术介绍

[0002]利什曼病(leishmaniasis)，又称黑热病。它的病原体是几种趋内脏的利什曼原虫。原虫主要寄生于病人体内的巨噬细胞里，由双翅目昆虫白蛉为传播媒介。临床特征主要表现为长期不规则的发热、脾脏肿大、贫血、消瘦、白细胞减少和血清球蛋白的增加。如不予合适的治疗，患者大都在得病后1
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2年内因并发其它疾病而死亡。
[0003]世界卫生组织把黑热病列为再度回升的一种寄生虫病。黑热病的分布极广，波及亚、欧、非及拉美四大洲。全球超过88个国家有黑热病流行，约有3.5亿人口生活在疫区，每年有新感染病例10万左右，各地黑热病的流行病学特征不尽相同。中国一直受到黑热病的困扰，黑热病在我国长江以北的16个省、直辖市、自治区曾广泛流行，包括辽宁、河北、北京市、山东、江苏、安徽、河南、湖北、陕西、山西、四川、甘肃、青海、宁夏、内蒙古和新疆。在新疆、甘肃、四川、陕西、山西和内蒙古6省、自治区，黑热病从来没有消失过。
[0004]防治利什曼病，世界卫生组织把疫苗的研发列为重要策略任务。过去有三代抗利什曼原虫疫苗曾经进入到或正在临床试验阶段，但目前均没有证据达到世界卫生组织的有效性。第一代抗利什曼原虫疫苗包括三个主要类型：完整杀死寄生虫、部分分离利什曼原虫抗原、减毒活病原体。完整杀死利什曼原虫疫苗成本低，在人体内成功应用于I期和II期临床试验，充分证明了其安全性和免疫原性；然而，该疫苗未能在随机临床试验(RCT)的III期取得令人满意的结果。部分分离利什曼原虫抗原疫苗和减毒活病原体疫苗主要用于犬利什曼病的防控。通过基因工程细胞产生的重组蛋白被称为“第二代疫苗”。典型代表是LEISH
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F1，原名Leish
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111f，已进入临床二期。这种人工蛋白是由三个基因编码：硕大利什曼原虫的真核硫醇特异性抗氧剂(L.major homologue of eukaryotic thiol
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specific antioxidant,TSA)，硕大利什曼原虫应激诱导蛋白1(L.major stress
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inducible protein
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1,LmSTI1)，和L.braziliensis伸长和起始因子(L.braziliensis elongation and initiation factor,LeIF)。LEISH
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F3是另一种多组分疫苗，由两种蛋白质组成：核苷水解酶(nucleoside hydrolase,NH)和甾醇24
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c
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甲基转移酶(sterol 24
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c
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methyltransferase,SMT)。第三代疫苗的代表是ChAd63，一种猿猴腺病毒载体疫苗(ChAd63)可以有效地诱导广泛的CD8+T细胞。这种疫苗编码KH基因，由两个杜氏利什曼原虫抗原基因组成：KMP
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11和HASPB。研究表明，ChAd63
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KH能有效诱导干扰素
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γ的产生和树突状细胞的活化。
[0005]利什曼原虫蛋白，即利什曼原虫糖体磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(glycosomal phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)是糖异生的关键酶，是最近发现的最有免疫优势的利什曼病抗原。在利什曼原虫感染的高峰期，所有利什曼原虫的反应性T细胞中，近20％T细胞是PEPCK特异性的。此外，该研究发现，从人畜共患的利什曼原虫感染中恢复的人
的外周血单核细胞(PBMC)识别出PEPCK，表达高水平的干扰素γ(IFN
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γ)和颗粒酶B，提示具有潜在的临床益处。PEPCK是主要利什曼原虫的关键代谢酶和关键毒力因子。在利什曼原虫的代谢、毒力和免疫致病性中起关键作用。PEPCK的靶向丢失会导致利什曼原虫增殖受损和致病性高度减弱。因此这个蛋白目前成为控制利什曼原虫感染的首选靶标。
[0006]自将近半个世纪的发现以来，复制缺陷的腺病毒载体(Adenovirus vector，AdV)已迅速成为疫苗开发的有吸引力的平台。具有优异的安全性记录、广泛的组织嗜性。腺病毒是高度免疫原性的，能够驱动编码抗原的健壮持久的免疫应答。在诱导有效的CD8以及在诱导CD4 T细胞应答方面特别有效。这使它成为针对细胞内病原体的疫苗的诱人平台。
[0007]因此考虑将利什曼原虫蛋白，即利什曼原虫糖体磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(glycosomal phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)与复制缺陷的腺病毒载体结合起来，构建一种高效表达PEPCK的人复制缺陷型重组病毒载体将有助于对利什曼病的防治。

技术实现思路

[0008]针对上述问题本专利技术提供了一种高效表达PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0010]本专利技术提供了一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5
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L.m
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PEPCK，具体通过以下步骤制备得到：
[0011]步骤1，根据PEPCK基因(NCBI GenBank数据库条目XM_003721939.1；Leishmania major strain Friedlin)的编码序列，合成携带在羧基末端含6x His标签的PEPCK全长编码基因；
[0012]步骤2，对步骤1合成的羧基末端含6x His标签的PEPCK基因进行修饰，即在PEPCK基因羧基末端添加11个额外的修饰氨基酸；
[0013]步骤3，将步骤2修饰后的PEPCK
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His基因和pShuttle
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CMV载体通过NotI和EcoRV双酶切，构建重组载体pShuttle
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CMV
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Leish
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PEPCK；
[0014]步骤4，根据AdEasy腺病毒载体系统，将步骤3构建的重组载体pShuttle
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CMV
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Leish
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PEPCK与pAdEasy
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1载体进行同源重组，以生成所述重组腺病毒载体Ad5
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L.m
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PEPCK；
[0015]步骤5，重组腺病毒载体Ad5
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L.m
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PEPCK的分离纯化。
[0016]进一步，所述步骤2中11个额外的修饰氨基酸的序列为GRALEHHHHHH。
[0017]进一步，所述步骤3的具体过程为：将经过步骤2修饰后的PEPCK本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于，所述重组腺病毒载体为Ad5
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L.m
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PEPCK，具体通过以下步骤制备得到：步骤1，合成携带在羧基末端含6x His标签的PEPCK全长编码基因；步骤2，对步骤1合成的羧基末端含6x His标签的PEPCK基因进行修饰，即在PEPCK基因羧基末端添加11个额外的修饰氨基酸；步骤3，构建重组载体pShuttle
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CMV
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Leish
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PEPCK；步骤4，将步骤3构建的重组载体pShuttle
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CMV
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Leish
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PEPCK与pAdEasy
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1载体进行同源重组，生成所述重组腺病毒载体Ad5
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L.m
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PEPCK；步骤5，重组腺病毒载体Ad5
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L.m
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PEPCK的分离纯化。2.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于：所述步骤2中11个额外的修饰氨基酸为GRALEHHHHHH。3.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于，所述步骤3的具体过程为：将经过步骤2修饰后的PEPCK基因和pShuttle
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CMV载体分别通过NotI和EcoRV进行双酶切，然后用DNA连接酶连接，将连接产物转染进大肠杆菌DH5α中，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖平板上，37℃培养过夜，挑选抗性细菌克隆，增值培养后提取质粒DNA，通过DNA序列测定鉴定出重组载体pShuttle
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CMV
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Leish
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PEPCK。4.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于，所述步骤4的具体过程为：用PmeI限制性内切酶切割重组载体pShuttle
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CMV
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Leish
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PEPCK，然后用碱性磷酸酶在37℃处理30min，使用琼脂糖进行分离、纯化；将上述分离、纯化后的pShuttle...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢力，吴长新，潘元晴，郭凡，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：