腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新型腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用。本发明专利技术的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且获得的病毒感染能力强。同时，本发明专利技术的腺病毒表达载体可容纳较大的外源基因，具有很大的应用价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用


[0001]本专利技术属于生物医学以及病毒学领域，更具体地，本专利技术涉及一种新型腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒，它们的制备方法及应用；较佳地，所述腺病毒载体AdC68XY基于合成生物学技术构建。

技术介绍

[0002]腺病毒载体是目前最有应用前景的病毒载体之一。腺病毒是一种无包膜、线性的双链DNA病毒，基因组大小约为36kb。自1953年首次发现腺病毒至今，已分离出57种人血清型(分为A～G 7个亚属)及多种其它种属来源的腺病毒，其中最常见的是人血清5型腺病毒，即AdHu5。腺病毒由于转导效率高、可携带外源基因，易于扩增及纯化，被视为优良的基因运载工具，广泛应用于各种基础研究或临床应用，包括研发针对HIV、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病、前列腺癌、黑色素瘤等疾病的疫苗，以及用于溶瘤治疗。然而，由于75-80％的个体中存在抗AdHu5的预存中和抗体，以AdHu5为载体的疫苗，其免疫效果受预存中和抗体的影响，不仅削弱其免疫效果，而且可能增强副反应。为避免这一问题，本专利技术人之前选择稀有血清型或其它种属来源的腺病毒作为疫苗载体，如黑猩猩型腺病毒等。黑猩猩型腺病毒只流行于非洲的黑猩猩中，人群中一般不含抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，故以黑猩猩型腺病毒为疫苗载体，其综合免疫效果优于AdHu5载体。
[0003]由于腺病毒基因组相对较大，一般的分子生物学方法难以完成重组腺病毒载体的构建，因此，腺病毒载体的构建依然是一个技术瓶颈。传统的腺病毒载体构建策略主要为同源重组和基因组直接克隆，这些策略费时费力，最快也需要2个多月时间。进一步改良的策略为等温组装法，虽然这种方法声称只需要1周左右，但这只是指将多个片断用等温组装法连接在一起成为一个克隆所需的时间，尚不包括获得接头部位存在互补序列的多个小片段所需的时间以及验证过程。而且，以上这些策略都必须首先获得野生型病毒，并扩增纯化病毒，获得其基因组DNA。如果只知腺病毒基因序列，则无法完成腺病毒载体的构建。
[0004]综上，本领域还需要进行进一步的研究探索，来获得改进的腺病毒载体以及腺病毒，增强其临床上的应用性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供基于合成生物学技术构建的新型腺病毒载体AdC68XY。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，删除其E1序列和E3序列，改造其E4序列；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。
[0007]在本专利技术的另一方面，提供一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列和E3序列被删除，E4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。
[0008]在一个优选例中，前述方法或载体中，所述改造选自：
[0009](a)以AdHu5基因组E4序列替换AdC68基因组E4序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域插入AdHu5基因组第32914-35641位序列；
[0010](b)以AdHu5基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列替换AdC68基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-34671位序列，在该删除区域插入AdHu5基因组第32914-34077位序列；或
[0011](c)以AdHu5基因组E4序列中ORF3～ORF6序列替换AdC68基因组E4序列中ORF1～ORF6/7序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域插入AdHu5基因组第33193-34703位序列。
[0012]在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体中还包括选自以下操作性相连的元件或基因：外源基因表达盒；报告基因的表达盒；反向末端重复序列；和/或酶切位点；较佳地包括(但不限于)：HpaI，I-CeuI，PI-SceI，SwaI，PacI。
[0013]在另一优选例中，所述报告基因的表达盒具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0014]在另一优选例中，所述酶切位点包括用于插入外源基因的酶切位点。
[0015]在另一优选例中，所述外源基因表达盒可表达获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。
[0016]在另一优选例中，所述外源基因为长度在30bp～8.5kb的外源基因，如长度为50bp，100bp，200bp，500bp，1kb，2kb，3kb，4kb，5kb，6kb，7kb，8kb。
[0017]在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体是利用人工合成技术构建。
[0018]在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体具有SEQ ID NO:1(AdC68XY1-EGFP)所示的核苷酸序列，但，其中第29278～31865位由SEQ ID NO:3替换；其中第29278～30431位由SEQ ID NO:4替换；或其中第29278～31865位由SEQ ID NO:5替换。
[0019]在本专利技术的另一方面，提供前面任一所述的重组腺病毒载体的用途，用于制备重组腺病毒；或，用于插入外源基因、从而表达外源基因。
[0020]在本专利技术的另一方面，提供一种重组腺病毒，其由前面任一所述的重组腺病毒载体包装获得。
[0021]在本专利技术的另一方面，提供一种制备所述的重组腺病毒的方法，所述方法包括：(1)制备前面任一所述的重组腺病毒载体；和(2)将(1)的重组腺病毒载体转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。
[0022]在一个优选例中，所述的病毒生产细胞是可以实现病毒包装的细胞；较佳地包括：HEK293细胞。
[0023]在本专利技术的另一方面，提供所述的重组腺病毒的用途，用于：表达外源基因，从而获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体，具有杀伤活性的蛋白(如杀肿瘤的蛋白))，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。
[0024]在一个优选例中，所述的具有免疫原性的蛋白包括但不限于：针对HIV、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病、前列腺癌、黑色素瘤等疾病的蛋白疫苗。
[0025]在本专利技术的另一方面，提供一种试剂盒，包括：前面任一所述的重组腺病毒载体；前面所述的重组腺病毒；和/或病毒生产细胞。
[0026]本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
[0027]图1、重组腺病毒载体pAdC68XY1-EGFP的载体构建示意图图中，E1区已完全删除本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，删除其E1序列和E3序列，改造其E4序列；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。2.一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列和E3序列被删除，E4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。3.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述改造选自：(a)以AdHu5基因组E4序列替换AdC68基因组E4序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域插入AdHu5基因组第32914-35641位序列；(b)以AdHu5基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列替换AdC68基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-34671位序列，在该删除区域插入AdHu5基因组第32914-34077位序列；或(c)以AdHu5基因组E4序列中ORF3～ORF6序列替换AdC68基因组E4序列中ORF1～ORF6/7序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域插入AdHu5基因组第33193-34703位序列。4.如权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：周东明，邢嫚，祝丰，
申请(专利权)人：苏州相奕生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：