一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用，具备更高的病毒滴度，并提供了其病毒滴度的测定方法；创造性地通过穿梭质粒构建了黑猩猩腺病毒环状载体，并通过CRISPR/Cas9敲除E1、E3，构建了复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体。所述黑猩猩腺病毒载体在人群中没有预存抗体存在，E1、E3的敲除具有安全性，同时与293细胞中人类腺病毒5型E1有显著差异性，可以极大地避免恢复突变(RCA)，更具有安全性。构建的新型冠状病毒疫苗，经过几十代的传代，疫苗的稳定性很强，不引起突变，在小鼠模型中能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。

【技术实现步骤摘要】
一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用
[0001]本申请主张中国在先申请,申请号:2020106427453，申请日2020年7月6日的优先权；主张中国在先申请,申请号:202010945335.6，申请日2020年9月10日的优先权；其所有的内容作为本专利技术的一部分。


[0002]本专利技术涉及基因工程
和免疫学领域，具体而言，涉及一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0003]腺病毒是引起上呼吸道和肺部疾病的常见病毒，人体免疫系统会对腺病毒产生强烈的免疫应答。因此需要将腺病毒改造成无害化的疫苗载体，经过几十年的研发，市场运用较广范的即为人类腺病毒5型疫苗载体。腺病毒作为疫苗病毒大受欢迎，通常基因治疗采用的腺病毒载体以人5型腺病毒(AdHu5)为主，但人群中普遍存在针对AdHu5的中和抗体，约有三分之一的人群成年时已对其产生免疫性，这些人群的免疫系统会破坏疫苗而不是产生对抗携带插入基因的病毒的抗体。并且，AdHu5的Hexon蛋白与血液中的凝血因子X(FX)结合，导致该腺病毒在肝脏累积，影响AdHu5的肿瘤靶向性。因此，5型腺病毒的效能和靶向性有待进一步提高和完善。
[0004]黑猩猩腺病毒为我们提供另一种可行的方法，由于黑猩猩型腺病毒如AdC7、AdC23等在人群中很少流行，人群中一般不存在相应的中和抗体，也不会被针对人5型腺病毒(AdHu5)的抗体所中和，同时，黑猩猩腺病毒的Hexon蛋白也不与FX结合。因此，黑猩猩腺病毒载体可发展为一种理想的腺病毒载体平台，可用于制备更高质量的疫苗试剂，如新型冠状病毒疫苗等，而且保持固有的安全性。
[0005]2019新型冠状病毒(2019
‑
nCoV)，从2019年开始在全球范围内大量爆发，引起了严重的疾病，造成了巨大的损失。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。
[0006]新冠病毒共表达29个蛋白、其中16个与其复制有关，4个是结构蛋白，刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)。S蛋白是冠状病毒最为重要的表面蛋白，S蛋白能与人体ACE2(宿主细胞受体血管紧张素转化酶2)结合，其亲和力要远高于严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS
‑
CoV)，S蛋白是进入细胞的钥匙、是抗体药物的靶点。N蛋白在冠状病毒中含量丰富，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节。
[0007]新冠肺炎患者体内的抗体会在数月内消失，而疫苗提供的抗体可能也会如此，这意味着人们无法通过一次性注射疫苗“一劳永逸”，抗体会在短时间内消退，消退早晚取决于最高点的抗体水平，这决定了抗体能在体内存留多久。因此如何提高患者体内新冠肺炎病毒的抗体水平，是制备新型冠状病毒疫苗需要考虑的首要问题。
[0008]经过检测，人群血清中不含有黑猩猩腺病毒的预存抗体，免疫系统就不会破坏疫苗，有助于目的抗原的有效表达，提高抗体的水平，因此黑猩猩腺病毒作为疫苗载体是一个很好的平台。现有的黑猩猩腺病毒的滴度普遍较低，构建成疫苗载体的工艺复杂，难以工厂化。因此急需找到滴度更高的黑猩猩腺病毒载体，形成完整工艺平台，从而用于新型冠状病毒疫苗等各类疫苗的制备。

技术实现思路

[0009]为解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种全新的病毒滴度更高的黑猩猩腺病毒，利用其制备的缺陷型黑猩猩腺病毒载体，可用于制备新型冠状病毒疫苗等各类疫苗，本专利技术提供的黑猩猩腺病毒疫苗载体在人群中没有预存抗体的存在，与293细胞中人类腺病毒5型E1有十分高的差异性，可以极大地避免恢复突变，更具有安全性；同时具有更好的稳定性；在小鼠模型中能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。
[0010]一方面，本专利技术提供了一种黑猩猩腺病毒，所述的该病毒包括高变区HVR，其中，所述的高变区HVR包括如序列编号Seq ID NO.9、Seq ID NO.10、Seq ID NO.11、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、或者Seq ID NO.14所示的中的任意一条或多条所示的核苷酸序列，或者与以上序列具有同源性大于50％的核苷酸序列。
[0011]人腺病毒属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，到目前为止，人腺病毒共分离到52个血清型，分属于A～G7个亚属。目前腺病毒感染的诊断与分型主要应用病毒分离技术、抗体检测技术，以及分子生物学技术(如聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析技术、原位杂交技术、实时荧光定量PCR技术)等。
[0012]黑猩猩腺病毒同样具有不同的血清型，其基因序列包括高变区HVR1
‑
9的序列和相对保守序列，相对保守序列可用于区别不同种属的腺病毒(如用于区别属于黑猩猩腺病毒还是人腺病毒)，而高变区序列可用于区别不同的腺病毒的血清型，即高变区的序列决定了腺病毒的具体血清型。
[0013]HVR1
‑
9的序列示意图如图1所示，在高变区具有9个区域是变化的，这些高变区域的核酸序列的不同，从而表达的蛋白或者结构不同，决定了病毒的血清型的不同。一般腺病毒的高变区具有9个区域，这9个区域的排列方式如图1所示。所谓的“血清型”是指，微生物学上,可以用来鉴定同种类微生物的不同型别,通常可用血清学方法检测出来,谓之血清型。比如琏球菌主要通过O抗原和H抗原的滴定效价来确定其血清型。
[0014]本专利技术提供的新型黑猩猩腺病毒，其基因序列主要基于黑猩猩腺病毒的六邻体基因高变区HVR1
‑
6的序列。本专利技术提供的黑猩猩腺病毒的六邻体基因高变区HVR1
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6的序列中的每一个区域的序列与数据库(genebank)中的已知黑猩猩腺病毒的血清型HVR1
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6序列完全不同，或者存在巨大的差异。所述的六邻体基因高变区HVR1
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6的序列共包含六个突变序列，分别位于HVR1
‑
6序列的每个序列中，其中HVR1如序列表编号Seq ID NO.9所示的序列、HVR2如序列编号Seq ID NO.10所示的序列、HVR3如序列Seq ID NO.11所示的序列、HVR4如序列表Seq ID NO.12所示的序列、HVR5如序列表Seq ID NO.13所示的序列、HVR6如序列表Seq ID NO.14所示的核苷酸序列。本专利技术的腺病毒在高变区HVR7
‑
9位置的的序列并未发生突变，如序列表Seq ID NO.15所示。
[0015]本专利技术的一般技术人员可以理解，这些高变区的序列一旦公布，可以对其序列进
troglodytes adenovirus clone 17.2major capsid protein gene(GenBank:MF176134.1)的部分基因，最大本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黑猩猩腺病毒，其特征在于，所述的该病毒包括高变区HVR，其中，所述的高变区HVR包括如序列编号Seq ID NO.9、Seq ID NO.10、Seq ID NO.11、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、或者Seq ID NO.14所示的中的任意一条或多条所示的核苷酸序列，或者与以上序列具有同源性大于50％的核苷酸序列。2.权利要求1所述的黑猩猩腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒包括高变区HVR7
‑
9的区域，所述高变区HVR7
‑
9具有如序列表Seq ID NO.15所示的核苷酸序列。3.如权利要求1
‑
2任一项所述的黑猩猩腺病毒，其特征在于，高变区HVR具有如序列表Seq ID NO.7所示的核苷酸序列，或者与该序列同源性大于50％的核苷酸序列。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的黑猩猩腺病毒，其特征在于，所述的病毒还包括保守区域。5.一种黑猩猩腺病毒，其特征在于，该病毒的保藏编号为CCTCC NO：V202120，编号为sAd
‑
AY01的毒株。6.如权利要求5所述的黑猩猩腺病毒，其特征在于，具有如序列表Seq ID NO.1所示的核苷酸序列。7.一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，其特征在于，如权利要求1～6任一项所述的黑猩猩腺病毒，保守区域缺失基因。8.如权利要求7所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，其特征在于，所述缺失的基因包括E1、E2A、E2B、E3、E4中的任意一种或多种。9.如权利要求8所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，其特征在于，缺失E1和E3基因，具有如序列表Seq ID NO.4所示的核苷酸序列。10.一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建穿梭质粒psAd
‑
shuttle，线性化后与如权利要求1～6任一项所述的黑猩猩腺病毒基因进行同源重组，制备环状质粒psAd；(2)敲除psAd的E1基因，获得E1基因缺失的黑猩猩腺病毒载体psAd
△
E1；(3)敲除psAd
△
E1的E3基因，获得缺失E1和E3基因的黑猩猩腺病毒载体psAd
△
E1
△
E3。11.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈平，李娜，张婷婷，钟鑫涛，李楠，
申请(专利权)人：嘉兴安宇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：