一种串联表达的口蹄疫病毒VLP亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种串联表达的口蹄疫病毒VLP亚单位疫苗，所述疫苗含有通过SF9真核表达系统表达的串联的口蹄疫病毒A型和O型病毒样颗粒(VLP)。所述方案能表达A

【技术实现步骤摘要】
一种串联表达的口蹄疫病毒VLP亚单位疫苗
[0001]本申请主张中国在先申请,申请号:202010665408.6，申请日2020年7月11日的优先权；其所有的内容作为本专利技术的一部分。


[0002]本专利技术涉及基因工程
和免疫学领域，具体而言，涉及一种串联表达的口蹄疫病毒VLP亚单位疫苗及其构建方法。

技术介绍

[0003]口蹄疫(Foot
‑
and
‑
mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot
‑
and
‑
mouth disease virus，FMDV)引起的动物急性、烈性传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄动物，发病率极高，能造成巨大的经济损失。
[0004]口蹄疫病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asia1(亚洲 1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。
[0005]口蹄疫病毒颗粒呈圆形，表面光滑，直径约27～30nm。病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，FMDV的ORF编码一个大的聚合蛋白，在病毒翻译的同时，也伴随着聚合蛋白的剪切、折叠等翻译后的加工。
[0006]口蹄疫病毒包括结构蛋白基因P1和非结构蛋白基因P2、P3，其中P1基因编码口蹄疫病毒的抗原结构，是研究口蹄疫免疫机制和新型疫苗的基础，长约2200nt，能在2A和3C蛋白酶的作用下裂解产生4种基因，1A、1B、1C、1D，分别编码VP4、VP3、VP2、VP1四种结构蛋白，并组装成病毒的衣壳，由蛋白衣壳包裹基因组RNA组成核衣壳。
[0007]病毒样颗粒(VLP)具有与真实病毒粒子大小相似的结构，能引起免疫应答但不具有感染性，可模拟病毒真实空间结构，又不需要冒险培养真实病毒。VLP疫苗为利用微生物的表面结构成分(抗原)来制成不含核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，又称VLP亚单位疫苗。
[0008]口蹄疫病毒是无囊膜的RNA病毒，其结构蛋白可组装成VLP，且具有良好的免疫原性，可以用于生产疫苗，也可用于检测口蹄疫病毒中和抗体，因此制备口蹄疫病毒的VLP 亚单位疫苗具有很好的应用前景。
[0009]目前国内流行口蹄疫病毒血清型主要是A型和O型。因此进行口蹄疫防疫工作时，需要免疫两种血清型的疫苗。目前市面上口蹄疫病毒疫苗在A型和O型双价苗选择很有限，价格也较为昂贵，因为双价苗需要培养A型和O型两种病毒，如采用一条生产线存在交叉污染风险，必须采用两条高等级生物安全生产线分别进行生产口蹄疫病毒A型和O型灭活疫苗，生产成本较高。还有一种选择是分别免疫口蹄疫病毒A型和O型两种疫苗，购买两种疫苗成本也不低，而且免疫程序更复杂，不利于降低养殖成本。
[0010]基于灭活工艺生产的口蹄疫病毒疫苗，需要特定的高等级生产设施，生产成本高，并且可能存在泄漏或灭活不彻底的散毒风险。再者对于还没有规模培养工艺的口蹄疫病毒
或者本地区未发现但已公布序列的毒株无法迅速开发对应的疫苗。因此口蹄疫病毒的VLP 亚单位疫苗为目前制备口蹄疫病毒疫苗的最佳选择，能模拟口蹄疫病毒真实空间结构，又不需要冒险培养口蹄疫病毒。
[0011]因此急需一种直接通过一条生产链即可完成的，能够完整表达口蹄疫A型和O型两种独立抗原的、更安全的VLP疫苗。

技术实现思路

[0012]为解决上述问题，本专利技术提供一种串联表达的口蹄疫病毒VLP亚单位疫苗，运用两个 VLP串联共用一个3C蛋白酶，减少3C蛋白酶表达来提高VLP产量，同时运用口蹄疫病毒基因自带的2A来自酶切分离两个VLP和3C蛋白酶，通过SF9真核表达系统串联表达口蹄疫病毒A型和O型两种抗原的VLP，制得的VLP具有与真实病毒粒子大小相似的结构，模拟口蹄疫病毒真实空间结构，能引起免疫应答但不具有感染性，仅需一条生产链即可完成，串联表达的总产量更高，提升30％以上，成本更低，可以激发强大的体液免疫和细胞免疫，具有完整的病毒外壳结构，更多的抗原位点，可以更好地对抗病毒变异。
[0013]一方面，本专利技术提供了一种口蹄疫病毒VLP疫苗，所述疫苗由融合片段 A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmutan在表达体系中表达形成，所述表达系统选自大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或者哺乳动物细胞中的任一种。
[0014]进一步地，所述融合片段A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmutant具有如序列表中Seq ID NO.3所示的核苷酸序列；A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmutant氨基酸序列推导得到的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.7所示；所述表达体系为SF9真核表达系统。
[0015]再一方面，本专利技术提供了一种口蹄疫病毒VLP疫苗的制备方法，通过口蹄疫病毒A型的A
‑
P12A基因和O型的O
‑
P12A3C
‑
mutant基因，制得融合片段A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmutant，再经表达体系中表达形成。
[0016]口蹄疫病毒的结构蛋白基因P1基因是编码口蹄疫病毒的抗原结构，在2A和3C蛋白酶作用下可裂解产生VP4、VP3、VP2、VP1四种结构蛋白，并组装成病毒的衣壳，由蛋白衣壳包裹基因组RNA组成核衣壳。
[0017]本专利技术提供的串联表达A型和O型两种抗原的VLP，运用两个VLP串联共用一个3C蛋白酶，减少3C蛋白酶表达来提高VLP产量，同时巧妙地分别运用口蹄疫病毒A型和O型基因自带的2A来自酶切分离两个VLP和3C蛋白酶，是一种非常理想的串联方式，能大幅提升 VLP的产量。如果两个VLP直接简单串联，中间不增加2A，则两个VLP没法分离形成A型和O型两种VLP；而且如果不共用3C蛋白酶，因用于表达蛋白的核酸量较大，容易造成VLP 产量低。
[0018]在一些方式中，经串联融合后的融合片段，经表达体系中表达形成重组杆状病毒。
[0019]在一些方式中，重组杆状病毒再经扩增，分子筛过柱纯化，去除2A和3C蛋白酶，获得更纯的口蹄疫A型和O型病毒蛋白，可用于制备VLP疫苗。
[0020]一些方式中，口蹄疫A型和O型病毒蛋白中可添加佐剂，用于制备VLP疫苗。
[0021]由于口蹄疫病毒株的不断变异，还需要及时跟进研制出新变异病毒株的有效疫苗，针对目前流行的A型东南亚97(A/Sea
‑
97)G2株和O型缅甸98(O/Mya
‑
98)毒株 (O/MYA98/BY/2010株)，专利技术人分别研制了针对A型东南亚97(A/Sea
‑
97)G2株和O 型缅甸98(O/Mya
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98)毒株(O/MYA98/BY/2010株)的VLP疫苗，同时还进一步研制了可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种口蹄疫病毒VLP疫苗，其特征在于，由融合片段A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmutan在表达体系中表达形成，所述表达系统选自大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或者哺乳动物细胞中的任一种。2.如权利要求1所述的VLP疫苗，其特征在于，所述A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmutant具有如序列表中Seq ID NO.3所示的核苷酸序列；A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmutant氨基酸序列推导得到的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.7所示；所述表达体系为SF9真核表达系统。3.一种口蹄疫病毒VLP疫苗的制备方法，其特征在于，通过口蹄疫病毒A型的A
‑
P12A基因和O型的O
‑
P12A3C
‑
mutant基因，制得融合片段A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmutant，再经表达体系中表达形成。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述O
‑
P12A3C
‑
mutant基因是将O
‑
P12A和O
‑
3C
‑
mutant进行融合PCR而获得，其中的O
‑
P12A和O
‑
3C
‑
mutant分别具有如序列表中Seq ID NO.4、Seq ID NO.5所示的核苷酸序列。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的O
‑
3C
‑
mutant是由O
‑
3C的第127个氨基酸由L变为P而获得，其中的3C具有如序列表Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述A
‑
P12A、O
‑
P12A3C
‑
mutant、A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmutant具有如序列表中Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3所示的核苷酸序列。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的A
‑
O
‑
VLP
‑
3Cmut...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈平，钟鑫涛，张婷婷，李娜，李楠，
申请(专利权)人：嘉兴安宇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：