一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用，通过构建包含复制子、抗性基因的穿梭质粒，制备Ad29腺病毒环化质粒，并通过CRISPR/Cas9技术，找到最合适的敲除位点，设计最佳的特异性靶向gRNA，特异性敲除Ad29腺病毒E1、E3基因，更高效、便利地制得复制缺陷型Ad29腺病毒载体。该腺病毒在人群中流行度小，平均中和滴度低，可用于制备新冠疫苗，稳定性强，并能诱导很强的体液免疫以及细胞免疫。疫。疫。

【技术实现步骤摘要】
一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用
[0001]本申请主张中国在先申请,申请号:2020106427453，申请日2020年7月6日的优先权；主张中国在先申请,申请号:202010945735.7，申请日2020年9月10日的优先权；其所有的内容作为本专利技术的一部分。


[0002]本专利技术涉及基因工程
和免疫学领域，具体而言，涉及一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0003]腺病毒是双链DNA病毒，呈无囊膜的球形结构，其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列，每个病毒颗粒包含一个36kb的线性双链DNA，两端各有一个100～600bp的反向末端重复序列(inverted terminal re
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peat，ITR)。腺病毒基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的E1～E4基因和晚期表达的与腺病毒颗粒组装相关的L1～L5基因。腺病毒的E1基因是复制增殖的必需基因，E3基因可以对抗宿主的免疫系统，敲除腺病毒的E1、E3后，腺病毒无法在正常细胞中进行增殖，丧失复制能力，敲除而其主要的表位抗原Hexon、Fiber等不受影响，因此采用复制缺陷的腺病毒作为载体，具有较高的安全性。同时，复制缺陷型的腺病毒载体可以在互补的细胞株中进行增殖，常见的互补细胞株例如表达Ad5E1基因的293细胞。在已经敲除E1、E3的基础上，进一步敲除E4，可以进一步提高腺病毒载体的容量，降低免疫原性。
[0004]腺病毒作为载体，其具有高安全性、有效的基因转导性和大规模生产的高效性等优点，在疫苗制备、基因治疗等领域具有十分广泛的应用。在全球范围内已有数百项临床试验采用腺病毒作为载体，占各类载体总和的24.8％，应用量居于首位。腺病毒5型(Ad5)、2型(Ad2)是当前被研究最多的两个腺病毒载体，但是普通人群往往会因为既往的腺病毒感染而产生腺病毒的中和抗体，这些中和抗体会限制腺病毒载体进入人机体细胞，使其无法行使免疫或者治疗功能，从而限制了传统的Ad5和Ad2腺病毒载体的应用水平。研究发现，非洲、南美以及我国等发展中国家的人群中Ad5、Ad2的中和抗体阳性率很高，甚至超过90％，这导致了Ad5和Ad2腺病毒载体的应用局限性。研究发现，来自于腺病毒D亚群的Ad29腺病毒，其能够避免Ad5预存的免疫性，又能在Ad5E1互补的细胞系中生长至高效价，并能够在初免—加强疫苗策略中诱导体液和细胞介导的免疫应答，因此，敲除腺病毒复制相关基因后的复制缺陷型Ad29腺病毒载体不仅可以用于研发，还可以用于大规模生产，是Ad2和Ad5腺病毒载体的良好替代品。
[0005]当前，复制缺陷型腺病毒载体的构建通常采用传统的分子操作方法，包括如下步骤：(i)应用cosmid将野生型腺病毒基因组(～35kb)组装到质粒载体上(～3kb)得到腺病毒载体；(ii)使用不同的专用穿梭质粒，通过多步骤同源重组敲除不同部位的目的基因组片段而得到复制缺陷型腺病毒载体，该方法操作复杂繁琐，需要设计多个穿梭质粒，耗时很长。当前亟待构建一种复制缺陷型Ad腺病毒载体以提高腺病毒载体在制备用于免疫和基因
治疗的药物中的应用，同时亟待开发一种能够高效、方便地构建复制缺陷型腺病毒载体的方法。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体，通过构建包含复制子、抗性基因的穿梭质粒，制备Ad29腺病毒环化质粒，并通过CRISPR/Cas9技术，找到最合适的敲除位点，设计最佳的特异性靶向敲除Ad29腺病毒E1、E3基因的gRNA，特异性敲除Ad29腺病毒E1、E3基因，更高效、便利地制得复制缺陷型Ad29腺病毒载体。该载体在人群中没有预存抗体存在，可用于制备新冠疫苗，稳定性强，并能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。
[0007]本专利技术所述的Ad29腺病毒是指人类腺病毒29型，其序列如Seq ID NO.15所示。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种基于Ad29腺病毒构建的环状载体，为环状质粒，包含复制子、抗性基因，所述复制子、抗性基因的序列分别如Seq ID NO.1、Seq ID NO.2所示。
[0009]人类腺病毒29型基因组是长约35,000bp的线性DNA，难以对其进行有效地分子操作，因此需要构建Ad29腺病毒环状质粒，才能让其在细菌中有效复制。
[0010]现有的方法构建环状质粒是通常采用cosmid(噬菌体)的方法，应用cosmid将野生型腺病毒基因组(～35kb)组装到质粒载体上(～3kb)得到腺病毒载体，因此需要购买相应的试剂盒，噬菌体还可能对实验室产生污染。
[0011]穿梭质粒通常用于表达载体，用于运载需要表达的基因至目的质粒中。
[0012]本专利技术创造性地采用穿梭质粒来构建Ad29腺病毒环状质粒，从而提供了一种更加便利的制备Ad29腺病毒环状质粒的方法。
[0013]由于Ad29腺病毒基因组的首尾存在ITR末端重复序列，大约为140bp，因此构建环状质粒的过程更加复杂，因重复片段容易缺失，通常会导致制备的Ad29腺病毒环状载体出现基因的缺失，导致腺病毒基因组不完整而不能在真核系统中复制。
[0014]本专利技术通过将细菌中复制相关的元件，复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)，连接Ad29基因组的左臂～1400bp片段，与右臂～1400bp的片段，并在BJ5183感受态进行同源重组，通过大量筛选，成功获得具备完整基因组的Ad29腺病毒环状质粒，能让其在细菌中有效复制。
[0015]本专利技术构建环状质粒的方法优点在于：1、不需要购买试剂盒，也避免使用噬菌体可能对实验室的污染；2、增加了EGFP荧光序列，可以检验TP0的转染效率；3、更加灵活，可以根据自己的需要构建自己所需要的元件。
[0016]进一步地，所述环状质粒还包括荧光表达框，所述荧光表达框为RSV promoter、EGFP、BGHpolyA中的任意一种。
[0017]为了监测质粒在细胞中的转染效率，增加了绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)，在转染到细胞后的TP0代通过荧光量的多少即可判断载体的转染效率。可以理解，这些并不是穿梭质粒所必须的，例如抗性基因(kanamycin)、绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)，当然，最为不必须的是绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种Ad29腺病毒载体环状质粒的构建方法，主要通过构
建穿梭质粒pAd29
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shuttle，线性化后与Ad29腺病毒基因进行同源重组，制备Ad29腺病毒环状质粒，所述穿梭质粒pAd29
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shuttle包含复制子、抗性基因和荧光表达框，所述穿梭质粒pAd29
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shuttle的序列如Seq ID NO.3所示。
[0019]本专利技术通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Ad29腺病毒载体，其特征在于，为环状质粒，包含复制子、抗性基因，所述复制子、抗性基因的序列分别如Seq ID NO.1、Seq ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的Ad29腺病毒载体，其特征在于，还包括荧光表达框，所述荧光表达框为RSV promoter、EGFP、BGHpolyA中的任意一种。3.如权利要求2所述的Ad29腺病毒的构建方法，其特征在于，主要通过构建穿梭质粒pAd29
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shuttle，线性化后与Ad29腺病毒基因进行同源重组，制备Ad29腺病毒环状质粒，所述穿梭质粒pAd29
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shuttle包含复制子、抗性基因和荧光表达框，所述穿梭质粒pAd29
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shuttle的序列如Seq ID NO.3所示。4.一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体，其特征在于，缺失E1和E3基因，或缺失E1、E3、E4基因。5.一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：1)制备Ad29腺病毒载体环状质粒；2)利用CRISPR/cas9敲除Ad29腺病毒载体的E1基因，获得了E1基因缺失的Ad29腺病毒载体pAd29
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E1；3)再利用CRISPR/cas9敲除Ad29腺病毒载体pAd29
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E1的E3基因，获得缺失E1和E3基因的Ad29腺病毒载体pAd29
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E1
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E3。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述CRISPR/cas9敲除E1基因的上游靶向序列和下游靶向序列，设计E1A
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gRNA和E1B
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gRNA，所述E1A
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gRNA和E1B
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gRNA的序列分别如Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)所述CRISPR/cas...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈平，张婷婷，李娜，钟鑫涛，
申请(专利权)人：嘉兴安宇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：