一种用于SMN1基因检测引物、试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种用于SMN1基因检测的引物对，并基于此，采用不对称PCR技术，制备得到了一种SMN1基因检测的试剂盒，从而实现通过探针熔解曲线法定性或定量检测SMN1基因的突变情况。其中，在针对SMN1基因突变的定量检测时，通过引入内部参考品进行扩增分析和数据校正，同时对扩增程序的优化调整，从而实现对样本中SMN1基因的拷贝数进行定量检测，并确保检测特异性高、保证定量准确。本发明专利技术还提出一种SMN1基因检测方法，样本DNA只需一步即可完成检测，检测快速，且可以精确定量SMN1基因exon7拷贝数，试剂成本低，其适用仪器在临床占有率高，非常适宜在临床中广泛应用。常适宜在临床中广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于SMN1基因检测引物、试剂盒及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及一种用于SMN1基因检测引物、试剂盒及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]脊髓性肌萎缩症(SMA)，是一类由脊髓前角运动神经元变性导致肌无力、肌萎缩的疾病。属常染色体隐性遗传病，临床并不少见。本病临床表现差异较大，根据患者起病年龄和临床病程，将SMA由重到轻分为4型。共同特点是脊髓前角细胞变性，临床表现为进行性、对称性，肢体近端为主的广泛性弛缓性麻痹与肌萎缩，智力发育及感觉均正常。其中具体表现如下：
[0003]1型：也称Werdnig
‑
Hoffman病，即婴儿型，约占全部SMA病例的45％。患儿出生后6个月内起病，出现迅速发展的进行性、对称性四肢无力，最大运动能力不能达到独坐。肌无力以近端为著，由于显著肌张力低下，平躺时下肢呈“蛙腿”样姿势。患儿表情及眼球运动正常，舌肌束颤，口咽部肌群无力导致哭声低弱、吸吮无力、咽反射减弱，易发生误吸。由于肋间肌受累比膈肌更重，导致矛盾呼吸，胸廓呈现特征性“钟形”畸形。呼吸肌无力突出，多数患儿在2岁内死于呼吸衰竭。
[0004]2型：也称Dubowitz病，即中间型，约占30％～40％。患者多在生后6～18个月起病，进展较1型慢，最大运动能力可达到独坐，但独坐年龄可能落后于正常同龄儿，不能独站或独走。肌无力以近端为著，下肢重于上肢，面肌及眼外肌不受累，舌肌萎缩伴肌束颤，四肢腱反射消失，肢体远端可观察到肌束颤。随着病程进展，出现吞咽困难、咳嗽无力、呼吸功能不全、脊柱侧弯、关节挛缩等合并症。部分患儿在儿童期丧失独坐能力。尽管寿命缩短，但多数可以活到成年期。
[0005]3型：也称Kugelberg
‑
Welander病，即青少年型，约占20％。患者多在出生18个月后起病，早期运动发育正常，可独走，部分独走时间延迟。随年龄增长出现以近端为主的肌无力，下肢重于上肢，最终部分丧失独走能力，逐渐依赖轮椅。随病情进展，可出现肢体肌束颤、足部畸形，部分患者因脊柱侧弯、呼吸功能不全等影响日常生活，预期寿命不缩短或轻度下降。
[0006]4型：晚发型，即成人型，早期运动发育正常，成人起病，出现肢体近端无力，进展缓慢，预期寿命不缩短。
[0007]由于SMN1(Survival Motor Neuron运动神经元生存)功能基因缺失或突变导致的SMA是一种常染色体隐性遗传疾病。95％的SMA患者是因为遗传了来自父母双方的7号外显子缺失的SMN1基因。表型正常的父母通常携带一个或两个正常SMN1基因。只携带一个正常的SMN1基因的人被称作携带者。少数情况下，2
‑
3％的人群携带2个正常SMN1基因，但这两个基因位于同一染色单体，这种情况下也是携带者。
[0008]SMA属于携带率高、发病率高的致残致死的严重性疾病，早期症状不明显，一旦发病无有效治疗手段，给家庭带来沉重的心理和经济上的负担，有进行筛查的必要性。95％的
SMA患者是因为遗传了来自父母双方的7号外显子缺失的SMN1基因，病因明确，可通过一次性基因检测检出，进而明确生育SMA患儿的遗传风险，或通过产前诊断降低人群中SMA患儿的出生率，是一种符合卫生经济学的筛查策略。2008年，美国医学遗传学会(ACMG)对SMA建议泛族裔筛查，即不分区域、种族，对所有孕龄人群无差别实施SMN1携带者基因筛查，对高风险胎儿实施产前诊断，从而减少SMA患儿的出生。2017年，美国妇产科学会(ACOG)要求所有备育或者已育女性进行SMA携带者筛查。
[0009]在SMA患者中最常见的突变是SMN1基因的纯合缺失，大部分携带者可检测到SMN1基因中一个等位基因的缺失，对SMN1基因外显子7、8进行检测，是SMA基因诊断和产前诊断的首选方法。
[0010]SMN1最常见的3种突变类型为：1)SMN1基因的缺失，2)SMN1基因转变成类似SMN2基因，前两种类型占全部变异的95％。3)SMN1点突变，目前发现约50余种点突变。
[0011]基因缺失的检测方法包括基于聚合酶链式反应的试验、变性高效液相色谱(DHPLC)、多重依赖性探针扩增法(MLPA)等。PCR
‑
RFLP是最初，也是最常用于确定SMA致病基因的检测方法。PCR
‑
RFLP的局限性在于，不能检出SMA携带者，也不能检出那些SMN1点突变型的SMA患者。MLPA使用双探针杂交连接技术检测SNP位点，当两条探针的连接点与模板完全匹配时，通过连接酶作用连接成一条单链，再通过探针上引入的引物序列进行扩增，而不扩增模板本身。若两条探针的连接点不能与模板完全匹配，则不发生连接反应，也不会被引物扩增。该方法可以用于SMN1和SMN2基因的定量。但MLPA方法为国外专利方法，产品价格昂贵，且需要多步反应，操作较为繁琐，耗时长(整个检测需要2天)。

技术实现思路

[0012]基于此，本专利技术的目的之一在于提出一种用于SMN1基因检测的引物对。
[0013]包括如下技术方案：
[0014]一种用于SMN1基因检测的引物对，所述引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，或为与SEQ ID NO.6所示至少有相似度为80％以上的序列；下游引物序列如SEQ ID NO.7所示，或为与SEQ ID NO.7所示至少有相似度为80％以上的序列。
[0015]本专利技术的目的之一还在于提出上述引物对在脊髓性肌萎缩症检测中的应用。
[0016]本专利技术的目的之一还在于提出一种SMN1基因检测的试剂盒。
[0017]包括如下技术方案：
[0018]一种SMN1基因检测的试剂盒，其包括上述引物对，所述上游引物和下游引物在检测反应体系中的用量摩尔比为2～5。
[0019]本专利技术的目的之一还在于提出上述试剂盒在脊髓性肌萎缩症检测中的应用。
[0020]本专利技术的目的之一还在于提出一种非疾病诊断目的SMN1基因和/或SMN2基因定量检测方法。
[0021]包括如下技术方案：
[0022]获取待测生物样本核酸；
[0023]将上述生物样本核酸，采用上述试剂盒进行检测，获取样本检测的熔解曲线图；
[0024]提取上述熔解曲线分析图中导数峰对应的峰值，计算比值，从而确定SMN1基因和/或SMN2基因的拷贝数。
[0025]本专利技术的专利技术人基于对脊髓性肌萎缩症的深入研究，为了克服现有技术针对目前SMN1基因检测存在的不足，设计得到一种用于SMN1基因检测引物，
[0026]并基于此，采用不对称PCR技术，结合专利技术人精密设计的检测探针，制备得到了一种SMN1基因检测的试剂盒，从而实现通过探针熔解曲线法就能快速定性或准确定量检测SMN1基因的突变情况。其中，在针对SMN1基因突变的定量检测时，通过引入内部参考品进行扩增分析和数据校正，同时对扩增程序的优化调整，从而实现对样本中SMN1基因的拷贝数进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于SMN1基因检测的引物对，其特征在于，所述引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，或为与SEQ ID NO.6所示至少有相似度为80％以上的序列；下游引物序列如SEQ ID NO.7所示，或为与SEQ ID NO.7所示至少有相似度为80％以上的序列。2.权利要求1所述引物对在脊髓性肌萎缩症检测中的应用。3.一种SMN1基因检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对，所述上游引物和下游引物在检测反应体系中的用量摩尔比为2～5。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于SMN1基因定量检测的探针，所述探针序列如SEQ ID NO.9所示。5.根据权利要求3～4任一项所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于内参质控的引物对和探针；进一步地，所述用于内参质控的引物对序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示，所述探针序列如SEQ ID NO.10所示。6.根据权利要求3～5任一项所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于SMN1基因定性检测的探针，所述探针序列如SEQ ID NO.5所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小芳，李丙亮，翟建新，
申请(专利权)人：上海科亦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：