本发明专利技术公开了一种检测SCN1A基因毒外显子变异的方法，先根据SCN1A基因毒外显子保守区域设计引物，用测试样本的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行测序，在测序结果中查找突变信息并注释，根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》进行以下评级：a.人群频率≥0.05，评级为B；b.人群频率≤0.0005或人群频率信息缺失，且该位点已有文献报道且完成功能验证，评级为P或LP；c.人群频率≤0.0005或人群频率信息缺失，且该位点未有文献报道，评级为VUS；d.0.0005＞人群频率＜0.05，结合家族史，评级为LB或VUS。该方法检测结果准确，可操作性强，相较于同类方法更加经济实惠，利于推广。利于推广。利于推广。
【技术实现步骤摘要】
一种检测SCN1A基因毒外显子变异的方法
[0001]本专利技术涉及生物学与精准医学全基因组变异检测与基因工程
，具体涉及一种检测SCN1A基因毒外显子变异的方法。
技术介绍
[0002]SCN1A基因定位于2号染色体长臂2q24.3，编码钠离子通道α1亚基Nav1.1，主要在中枢神经系统表达，其在调节脑部电生理兴奋性上发挥着重要作用。SCN1A基因突变使得钠离子通道的结构和功能异常，神经元兴奋性增强或降低，导致癫痫发作。在所有已知的癫痫致病基因中，SCN1A基因是人类癫痫最常见的致病基因，被称为超级罪犯基因，其致病变异导致严重程度不同的多种表型。最严重的表型是Dravet综合征(Dravet syndrome,DS)；较轻的表型包括癫痫伴热性惊厥附加症(generalized epilepsy with febrile seizures plus，GEFS+)和高热惊厥，癫痫发作的病程较轻，并且预后智力正常[PMID:32032478]。
[0003]Dravet综合征于1978年由Dravet等首次报道，又称为婴儿严重肌阵挛癫痫，是一种罕见的、与遗传相关的癫痫性脑病，发病率约为1/40000～1/30000，男女患病之比约为2:1，其特征是顽固性癫痫发作、精神运动发育迟缓、轻度至重度智力障碍、并伴有行走困难和行为问题，药物难治。Dravet综合征患儿中，60％～80％的患者中检测出SCN1A基因突变。除DS外，在至少2％的其它发育性癫痫性脑病患者中也发现了致病性SCN1A变异。
[0004]毒性外显子，或称无义介导mRNA降解外显子，是指一小段外显子区域，当被剪切进RNA转录本时，会导致未成熟的截短蛋白(premature truncated protein)。在神经发育过程中的某个特殊时期或者对于某些特异细胞，这类事件的发生会导致疾病。在SCN1A基因已检测到Intron23的变异可以导致毒性外显子产生，并且已报道的变异集中在一段进化上相对保守的区域[PMID:30526861]。
[0005]随着高通量测序技术的不断发展，全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)已经作为癫痫遗传分子诊断的常用技术方法，由于探针设计捕获的局限性，对于深度内含子区域的序列不能被捕获，因此深度内含子区域引起致病性变异的位点不能通过WES检测到。全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)，可以检测到内含子区域，但由于其高昂的价格及较长的检测周期难于大范围推广应用。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种检测SCN1A基因毒外显子变异的方法，操作简单，成本低，可为临床诊断为Dravet综合征但是WES未能发现致病性变异的情况提供数据参考。
[0007]本专利技术技术方案详述如下：
[0008]一种检测SCN1A基因毒外显子变异的方法，包括以下步骤：
[0009](1)根据SCN1A基因毒外显子保守区域设计引物，或引物和探针，以测试样本的DNA作为模板，进行PCR扩增，得扩增产物；
[0010](2)扩增产物进行测序，在测序结果中查找突变信息，对突变信息进行注释，突变信息包含人群频率，根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》，参考突变注释信息对变异位点进行以下评级：
[0011]a.人群频率≥0.05，评级为B，该变异为多态性位点；
[0012]b.人群频率≤0.0005或人群频率信息缺失，且该位点已有文献报道且完成功能验证，评级为P或LP；
[0013]c.人群频率≤0.0005或人群频率信息缺失，且该位点未有文献报道，评级为VUS；
[0014]d.0.0005＞人群频率＜0.05，结合其家族史等信息，评级为LB或VUS；
[0015]其中，P表示致病性变异；LP表示疑似致病性变异；VUS表示临床意义未明变异；LB表示疑似良性变异；B表示良性变异。
[0016]可选或优选的，上述方法中，步骤(1)中所述SCN1A基因毒外显子保守区域为chr2:166006890
‑
166007890，和/或chr2:166002374
‑
166003024。
[0017]可选或优选的，上述方法中，所述引物的核苷酸序列如下所示：
[0018]针对chr2:166006890
‑
166007890的扩增引物：
[0019]SCN1A_Intron23_F:CGCCCTCACCAATCCAGTA，
[0020]SCN1A_Intron23_R:AGCTGCGTCAAAGCGTAACT；
[0021]针对chr2:166002374
‑
166003024的扩增引物：
[0022]SCN1A_Intron22_F:ACTTCATCTGGCAGCAAGTTCC，
[0023]SCN1A_Intron22_R:GTTTTCACCCATCTGGGCTCAT。
[0024]可选或优选的，上述方法中，步骤(1)中所述测试样本为WES检测结果为阴性的前提下，符合以下条件至少一个的：
[0025]a.医生因怀疑SCN1A基因导致疾病而送检的样本；
[0026]b.符合Dravet综合征和/或全面性癫痫伴热性惊厥附加症的临床诊断标准的样本。
[0027]全面性癫痫伴热性惊厥附加症，generalized epilepsy with febrile seizure，GEFS+，是2001年国际抗癫痫联盟新命名的一种癫痫综合征，临床特征为高热惊厥家系中的患儿在6岁以后仍有高热惊厥或伴有无热惊厥，或兼有其他发作形式的癫痫综合征。
[0028]可选或优选的，上述方法中，步骤(2)中在测序结果中查找突变信息，是使用Mutation Surveyor软件对测序结果进行分析定位，并用chromas软件进行复查。
[0029]可选或优选的，上述方法中，步骤(2)中对突变信息进行注释采用ANNOVAR软件。
[0030]可选或优选的，上述方法中，所述突变信息还包括蛋白剪接预测结果和/或已经发表的变异信息。
[0031]可选或优选的，上述方法中，步骤(2)中所述b的情况，评级为P或LP按照以下标准区分：
[0032]评级为P的条件：满足条件
①
，同时满足
②‑⑥
中的至少一条；
[0033]评级为LP的条件：满足条件
①
，不满足
②‑⑥
中任何一条，满足或不满足条件
⑦
；
[0034]①
有功能验证实验；
②
检测样本经家系验证，为新发变异；
③
文献中的案例至少有一个是新发变异；
④
文献中的案例无新发变异，但在至少16个个体中检测到携带该变异；
⑤
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测SCN1A基因毒外显子变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据SCN1A基因毒外显子保守区域设计引物，或引物和探针，以测试样本的DNA作为模板，进行PCR扩增，得扩增产物；(2)扩增产物进行测序，在测序结果中查找突变信息，对突变信息进行注释，根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》，参考突变注释信息对变异位点进行以下评级：a.人群频率≥0.05，评级为B，该变异为多态性位点；b.人群频率≤0.0005或人群频率信息缺失，且该位点已有文献报道且完成功能验证，评级为P或LP；c.人群频率≤0.0005或人群频率信息缺失，且该位点未有文献报道，评级为VUS；d.0.0005＞人群频率＜0.05，结合测试样本的家族史信息，评级为LB或VUS；其中，P表示致病性变异；LP表示疑似致病性变异；VUS表示临床意义未明变异；LB表示疑似良性变异；B表示良性变异。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述SCN1A基因毒外显子保守区域为chr2:166006890
‑
166007890，和/或chr2:166002374
‑
166003024。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下所示：针对chr2:166006890
‑
166007890的扩增引物：SCN1A_Intron23_F:CGCCCTCACCAATCCAGTA，SCN1A_Intron23_R:AGCTGCGTCAAAGCGTAACT；针对chr2:166002374
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166003024的扩增引物：SCN1A_Intron22_F:ACTTCATCTGGCAGCAAGTTCC，SCN1A_Intron22_R:GTTTTCACCCATCTGGGCTCAT。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述测试样本为WES检测结果为阴性的前提下，符合以下条件至少一个的：a.医生因怀疑SCN1A基因导致疾病而送检的样本；b.符合Dravet综合征和/或全面性癫痫伴热性惊厥附加症的临...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍成佳，王义亭，王佳，王小冬，
申请(专利权)人：苏州赛美科基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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