基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法技术

本发明专利技术公开了一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，采用核酸蛋白检测仪的实时在线检测，监控胞磷胆碱的层析分离过程是否正常运转，并通过定时在线取样和HPLC检测器分析，控制洗脱过程和收集CDP

【技术实现步骤摘要】
基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法


[0001]本专利技术属于生物化学分离
，尤其涉及一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法。

技术介绍

[0002]胞磷胆碱(CDP
‑
C)为核苷衍生物，可改善头部外伤后或脑手术后意识障碍的意识状态及脑电图，促进脑卒中偏瘫病人的上肢运动功能的恢复，对促进大脑功能恢复、促进苏醒有一定作用。
[0003]胞磷胆碱(CDP
‑
C)的制备方法如下：利用酿酒酵母的多种酶协同作用，使得5
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胞苷酸(5
’‑
CMP)和磷酸胆碱生成胞磷胆碱(CDP
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C)；此过程是一种需要提供能量ATP的多酶反应，它巧妙地利用了酵母糖酵解酶系，只要添加葡萄糖，磷酸缓冲液，酵母就会生成ATP的特点，从而使这供能生物反应不断进行；上述技术中，生物转化反应具有转化率高，无化学反应的异构体产生，生产成本低，只需要常温常压并在水相反应等优点；但是酵母在生物催化反应同时亦有许多细胞内溶物渗出，这样为后续分离纯化带来一定困难；一般生物转化反应以后，升温85
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90℃，使酶灭活，蛋白质变性，然后用酵母离心机分离去除酵母和变性蛋白质；但是去除固体残渣后的反应液中除了含量CDP
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C以外，尚有未反应的CMP，中间体胞苷二磷酸 (CDP)和胞苷三磷酸(CTP)，还有作为副产物的胞苷(CR)等产物；另外还有磷酸缓冲液，色素和可溶性蛋白质及酵母细胞自溶物等。
[0004]现阶段关于胞磷胆碱分离纯化的研究如下：文献1[上海师范大学生物系：生物化学与生物物理学报，1976.8(3)]、文献2[黄颖等：医药工业，1985.16(1)]以及文献3(邱蔚然等，中国专利CN 101096380 B)；其中文献1和文献2主要介绍了通过装有769活性炭的炭柱，将CDP
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C、CMP、CDP、CTP、CR等核苷酸类物质全部吸附，而其他磷酸盐，可溶性蛋白质以及细胞自溶物大部分不被炭柱吸附，从而通过上样，水洗而去除，然后用10～50％乙醇加氨水或NaOH可以将CDP
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C、CMP、CDP、CTP、CR、等洗脱下来，这样炭柱洗脱液就可以通过阴离子交换树脂层析分离；上述技术中，由于离子交换吸附强度不同，CR由于不吸附在柱上，上样、水洗时候已流出，洗脱时最先获得的是CDP
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C，以后洗脱下来的是CMP、CDP、CTP 等混合物，但是阴离子交换树脂对色素等杂质吸附比较强，一般通过柱再生才能去除。文献3中通过大孔酚醛系弱酸树脂(HD
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1)吸附除去大分子及阳离子，然后再用弱碱D315和强碱HZ201树脂串联层析分离；此种层析分离纯化设计比较巧妙，充分应用了生物转化溶液中各种物质特性，能获得纯度较高的CDP
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C溶液，但是由于生物转化溶液中组分较多，分离周期较长(4～5天)而且需要至少每小时要检查流出液或洗脱液很多参数，需要熟练技术工人和化验员昼夜不停地检测分析；除此之外，整个工艺操作和分析繁杂，很容易造成人为误差，从而降低CDP
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C的产品质量和收率。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术的目的是提供一种基于智能控制的胞磷
胆碱层析分离方法，通过实时在线检测和智能化控制对层析分离工艺进一步改进，实现层析分离全流程无人化操作，过程控制更加精密便捷，从而提高工作效率，减少人为误差，降低劳动成本，使得层析分离过程更具追溯性，也保证了分离过程的高质量运行，并提高了CDP
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C的产品质量和收率。本专利技术中通过核酸蛋白检测仪(简称检测仪)的实时在线检测，监控上样、水洗过程中是否有CDP
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C流出，从而了解这一过程是否正常运转；通过定时在线取样和HPLC检测器分析，控制洗脱过程和收集CDP
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C溶液。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术第一方面提供了一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，包括以下步骤：
[0008]S10，炭柱上样，胞磷胆碱反应清液依次上样至由多根炭柱组成的柱层析系统中，经炭柱吸附后，采用核酸蛋白检测仪对每根炭柱流出液进行实时检测；
[0009]S20，炭柱水洗，上样结束后，对所述柱层析系统进行水洗，同时采用核酸蛋白检测仪对柱层析系统的流出液进行实时检测；
[0010]S30，炭柱洗脱，水洗结束后，采用洗脱液对柱层析系统进行分段洗脱，同时采用核酸蛋白检测仪和HPLC检测器对每根炭柱的流出液进行检测，直至所述柱层析系统的流出液中没有CDP
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C；
[0011]S40，阴柱上样、水洗、洗脱，经步骤S30得到的炭柱洗脱液上样至阴离子交换柱中，然后对所述阴离子交换柱进行水洗、洗脱，通过HPLC检测器对阴离子交换柱的流出液进行定时检测，并收集CDP
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C溶液，再将CDP
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C溶液浓缩、结晶、干燥。
[0012]优选地，所述步骤S10中：
[0013]所述柱层析系统由3～5根炭柱串联或叠加组成，每根炭柱之间设有均设有单向阀；和/或
[0014]所述柱层析系统的多根炭柱经浓度为1mol/L的盐酸浸泡处理；和/或
[0015]所述炭柱上样过程如下：所述胞磷胆碱反应清液先进入所述柱层析系统的第一根炭柱，当第一根炭柱的流出液A260≥0.5时，所述胞磷胆碱反应清液再进入第二根炭柱，以此类推，直至所述柱层析系统的最后一根炭柱的流出液A260≥0.5时，上样结束。
[0016]优选地，所述步骤S20中：
[0017]所述炭柱水洗过程中，采用去离子水或纯化水对柱层析系统进行水洗，所述去离子水或纯化水的体积为所述柱层析系统中炭柱体积的5～10倍；和/或
[0018]所述炭柱水洗过程中，当柱层析系统流出液中A260＜0.5时，排废，反之则收集流出液。
[0019]优选地，所述步骤S30中：
[0020]所述洗脱液采用质量百分浓度为10～15％的乙醇和浓度为0.1mol/L的NaOH 溶液；和/或
[0021]所述炭柱洗脱过程如下：在分段洗脱中，采用采用核酸蛋白检测仪和HPLC检测器对所述柱层析系统的每根炭柱的流出液进行实时检测；当所述柱层析系统第一根炭柱的流出液中A260＜0.5时，结束对第一根炭柱的洗脱，以此类推，直至所述柱层析系统最后一根炭柱的流出液中A260＜0.5时，洗脱结束。
[0022]优选地，所述步骤S40中：
[0023]所述阴离子交换柱采用盐酸或NaOH溶液进行处理；和/或
[0024]所述阴柱上样过程中，采用核酸蛋白检测仪实时检测所述阴离子交换柱的流出液，当A260＜0.5时，则排废，反之则上样结束；和/或
[0025]所述阴柱水洗过程中，采用去离子水或纯化水对所述阴离子交换柱进行水洗，所述去离子水或纯化水的体积本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，其特征在于，包括以下步骤：S10，炭柱上样，胞磷胆碱反应清液依次上样至由多根炭柱组成的柱层析系统中，经炭柱吸附后，采用核酸蛋白检测仪对每根炭柱流出液进行实时检测；S20，炭柱水洗，上样结束后，对所述柱层析系统进行水洗，同时采用核酸蛋白检测仪对柱层析系统的流出液进行实时检测；S30，炭柱洗脱，水洗结束后，采用洗脱液对柱层析系统进行分段洗脱，同时采用核酸蛋白检测仪和HPLC检测器对每根炭柱的流出液进行检测，直至所述柱层析系统的流出液中没有CDP
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C；S40，阴柱上样、水洗、洗脱，经步骤S30得到的炭柱洗脱液上样至阴离子交换柱中，然后对所述阴离子交换柱进行水洗、洗脱，通过HPLC检测器对阴离子交换柱的流出液进行定时检测，并收集CDP
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C溶液，再将CDP
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C溶液浓缩、结晶、干燥。2.根据权利要求1所述的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，其特征在于，所述步骤S10中：所述柱层析系统由3～5根炭柱串联或叠加组成，每根炭柱之间设有均设有单向阀；和/或所述柱层析系统的多根炭柱经浓度为1mol/L的盐酸浸泡处理；和/或所述炭柱上样过程如下：所述胞磷胆碱反应清液先进入所述柱层析系统的第一根炭柱，当第一根炭柱的流出液A260≥0.5时，所述胞磷胆碱反应清液再进入第二根炭柱，以此类推，直至所述柱层析系统的最后一根炭柱的流出液A260≥0.5时，上样结束。3.根据权利要求1所述的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，其特征在于，所述步骤S20中：所述炭柱水洗过程中，采用去离子水或纯化水对柱层析系统进行水洗，所述去离子水或纯化水的体积为所述柱层析系统中炭柱体积的5～10倍；和/或所述炭柱水洗过程中，当柱层析系统流出液中A260＜0.5时，排废，反之则收集流出液。4.根据权利要求1所述的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，其特征在于，所述步骤S30中：所述洗脱液采用质量百分浓度为10～15％的乙醇和浓度为0.1mol/L的NaOH溶液；和/或所述炭柱洗脱过程如下：在分段洗脱中，采用采用核酸蛋白检测仪和HPLC检测器对所述柱层析系统的每根炭柱的流出液进行实时检测；当所述柱层析系统第一根炭柱的流出液中A260＜0.5时，结束对第一根炭柱的洗脱，以此类推，直至所述柱层析系统最后一根炭柱的流出液中A260＜0.5时，洗脱结束。5.根据权利要求1所述的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，其特征在于，所述步骤S40中：所述阴离子交换柱采用盐酸或NaOH溶液进行处理；和/或所述阴柱上样过程中，采用核酸蛋白检测仪实时检测所述阴离子交换柱的流出液，当A260＜0.5时，则排废，反之则上样结束；和/或所述阴柱水洗过程中，采用去离子水或纯化水对所述阴离子交换柱进行水洗，所述去离子水或纯化水的体积为所述阴离子交换柱中树脂体积的5～10倍；和/或
所述阴柱水洗过程中，采用核酸蛋白检测仪实时检测所述阴离子交换柱的流出...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱蔚然，张艳，邱志云，周洁，王军，
申请(专利权)人：上海蔚之星生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：