一种检测大肠癌血清蛋白质的方法技术

本发明专利技术提供为一种对大肠癌进行检测的非侵入性的新方法——检测大肠癌血清蛋白质的质谱模型及构建方法。该模型由人血清蛋白质质谱、质谱仪及人工神经网络分析组成，血清蛋白质的质谱由四个质荷比（Ｍ／Ｚ）的蛋白质所组成。其构建方法包括血清准备、质谱数据的收集、质谱数据的人工神经网络分析。本发明专利技术提供的模型能够对大肠癌进行早期检测，其敏感性与特异性均达到９０％以上，是一种在蛋白质组学水平上的诊断，对大肠癌的早期发现，早期诊断提供了新的方法与标准，从而为降低我国大肠癌的病死率，提高大肠癌的治愈率，并进一步为高危人群筛查大肠癌提供一种新的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及恶性肿瘤检测领域，为一种新的非侵入性的检测方法，在体外对大肠癌进行早期发现，早期检测，其敏感性和特异性均达到90％以上。表面-增强激光解吸-电离(SELDI)根本的原理是通过使用特异的探针表面俘获蛋白质表面-增强亲合力，是最近两年才发展起来的一种新的蛋白组学的研究方法。SELDI可以克服二维凝胶电泳存在的内在问题，包括疏水性问题、强酸性、强碱性的蛋白质的分离、膜蛋白的分离问题、低分子量检测的灵敏性、低丰度蛋白质的灵敏性问题。蛋白质只要与SELDI蛋白质芯片阵列结合，就可通过电离-解吸飞行时间-质谱仪检测，并根据蛋白质的质量和电荷比(m/z)每一个蛋白质的峰值明显地分离并形成一个蛋白质(保留在芯片上的蛋白质)的图谱。目前，在非侵入性大肠癌的诊断中常有以下几种方法①粪便潜血试验，粪便潜血是最为常见的大肠癌早期指征之一，但仅有50％的大肠癌和30％腺瘤隐血试验阳性，假阴性太多，为此不少学者致力于改进隐血试验的方法，如愈创木脂法，免疫隐血试剂法等。其特异性虽然提高了，但敏感性却降低，且费用也增加了。②粪便生化与免疫学试验，应用免疫胶乳清蛋白试剂盒检测粪便中高于正常量的清蛋白，对隐血阴性的大肠癌的检测起到补充的作用，但其在大肠癌中的阳性率为55.4％，腺瘤为27.1％。此外，大肠癌患者粪便中的促腐因子，各种肿瘤伴随抗原和肿瘤相关产物的检测，在大肠癌早期诊断中也起到一定的帮助。③粪便中癌基因的检测，Doolittle等发现在46-50％的大肠癌病人的粪便中检测到K-Ras基因的突变。Dong等在大肠癌病人的粪便中对TP53，BAT26，and K-Ras基因进行检测也发现有71％的大肠癌中同时发生突变。④血液中肿瘤标记物的检测，Barillari等88例大肠癌患者的血清进行了CEA，TPA and CA 19-9的检测，发现它们的敏感性和特异性分别为72％、62％、38％和78％、86％、97％。Nicolini等对90例大肠癌病人的血清进行CEA，TPA，GICA，CA 72.4，和CA 195的检测，同样发现他们的敏感性与特异性仍徘徊在50-70％之间。⑤血液中癌基因的检测，Hibi等发现在44例大肠癌病人的血清中检测到22例有K-Ras或p53基因的微卫星不稳定性。Salbe等也在35例病人中的血清中发现40％的病人有K-Ras基因的突变。Lauschke等的研究也证实在病人的血清中可检测到K-Ras和APC基因的突变。可见大肠癌早期诊断的方法很多，但均存在特异性与敏感性之间的矛盾，假阳性率和假阴性率高的问题。这也是困扰我们对大肠癌进行早期诊断的最重要的问题。本专利技术提供的模型由人血清蛋白质质谱、质谱仪及人工神经网络分析组成。本专利技术提供的人血清蛋白质质谱由四个质荷比(M/Z)位于5910±15Da，8930±15Da，4476±15Da和8817±15Da的蛋白质(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修饰前或修饰后)所组成。本专利技术的第二个目的是提供这种质谱模型的构建方法，包括①血清准备，②质谱数据的收集，③质谱数据的人工神经网络分析。本专利技术提供的质谱模型的构建方法，血清准备包括白蛋白亲和树脂CibacronBlue 3GA(Sigma)，以1％CHAPS作为去垢剂，20mM HEPES的缓冲液，采用H4蛋白质芯片(Ciphergen)。本专利技术提供的质谱模型的构建方法，质谱仪采用表面-增强激光解吸-电离-飞行时间-质谱仪(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry SELDI-TOF-MS)进行质谱数据收集，其中激光强度为130，检测敏感性为6。本专利技术提供的质谱模型的构建方法，采用反向传播(BP)人工神经网络的方法进行质谱数据的分析。本专利技术与其他非侵入性大肠癌的诊断方法比较具有以下优点(1)本专利技术提供的质谱模型，为早期诊断大肠癌提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。(2)与以往的传统的非侵入性方法比较具有极高的特异性与敏感性，其敏感性与特异性均达到90％以上，是一种在蛋白质组学水平上的诊断，对大肠癌的早期发现，早期诊断提供了新的方法与标准。(3)本专利技术模型的构建方法设计合理，可行，是为降低我国大肠癌的病死率、提高大肠癌的治愈率、进一步筛查大肠癌提供了一种新的方法。图2为部分健康人与大肠癌血清的蛋白质质谱图。图3为质荷比(M/Z)位于(A)5910Da，(B)8930Da，(C)4476Da和(D)8817Da的部分健康人与大肠癌血清的蛋白质质谱图。图4为人工神经网络训练图。图5为人工神经网络训练参数设置。实施例1 本专利技术的一种检测大肠癌血清蛋白质的质谱模型及构建方法1、技术路线血清标本在冰浴中解冻后3000rpm离心5分钟，取10ul加入90ul0.5％CHAPS(pH7.4)溶液中充分混匀(10分钟)，白蛋白亲和树脂(Cibacron Blue3GA(Sigma))预先用0.5％CHAPS平衡3次×5分钟，将Cibacron Blue 3GA与血清样本在4℃摇床上60分钟，12000rpm离心5分钟(4℃)，取上清溶液40ul。H4芯片(Ciphergen)预先用20mM HEPES(pH7.4)平衡2次×5分钟，将去除白蛋白后的血清标本用20mM HEPES(pH7.4)稀释至200ul，加至96孔的Bioprocessor(Ciphergen)，振荡平台上振荡60分钟。甩去血清标本，20mM HEPES(pH7.4)200ul清洗芯片3次×5分钟，再用去离子水清洗芯片2次×1分钟，干燥后加入0.5ul CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)×2次。上机检测。2、数据收集与处理应用PBS-II SELDI质谱仪(Ciphergen)，分析软件为Proteinchip Software3.0版。设定激光强度为150，灵敏度为6，收集数据的范围为1000-200000，收集位置从20-80，平均每点收集20次，收集总点数为140次。在收集每次实验数据前用标准蛋白芯片校正分子量。所有原始数据先用Proteinchip Software 3.0做校正(总离子强度及分子量的均一化)。先对训练组的2k-20k的峰值，用Proteinchip Software 3.0的biomark wizard过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，第二次的噪音过滤值为2，以10％为最小阈值聚类共产生多个分子量的质谱图。然后用相同方法获取测试组的多个相同分子量的质谱图。3、网络参数的优化对训练集用这多个变量建立一个神经网络。神经网络采用反向传播算法(用共轭梯度学习函数改进Trainscg)。具体设置为共有4层，输入输出层，和两个隐含层，每个隐含层有20个神经元。每一层都采用正切S形传递函数(Tansig)。随机初始化。输出神经元为1个，对应健康人和大肠癌患者的期望输出值，分别设为-1和1。首先对训练标本进行人工神经网络训练，得出一个模型，对模型进行检验，并利用此模型对未知血清进行盲法分析。实施例2 部分实例1、样本与仪器147例血清标本，其中5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测大肠癌血清蛋白质的质谱模型及其构建方法，其特征是：该模型由人血清蛋白质质谱、质谱仪及人工神经网络分析组成。

【技术特征摘要】
1.一种检测大肠癌血清蛋白质的质谱模型及其构建方法，其特征是该模型由人血清蛋白质质谱、质谱仪及人工神经网络分析组成。2.如权利要求1所述的检测大肠癌血清蛋白质的质谱模型，其特征是该蛋白质的质谱由四个质荷比(M/Z)位于5910±15Da，8930±15Da，4476±15Da和8817±15Da的蛋白质所组成。3.如权利要求1和2所述的检测大肠癌血清蛋白质的质谱模型的构建方法，其特征是①血清准备；②质谱数据的收集；③质谱数据的人工神经网络分析。4.如权利要求3所述的质谱模型的构建方法，其特征是血清准备包括白蛋白亲和...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈益定，郑树，胡汛，俞捷凯，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第二医院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]