一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法技术

本发提供了一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法，它包括补加乳糖和甘油的工艺；所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD

【技术实现步骤摘要】
一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法


[0001]本专利技术涉及发酵工程领域，尤其涉及一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法。

技术介绍

[0002]7-氨基头孢氨酸(7-ACA)是合成头孢类抗生素的关键性中间体，在其活性基团连接不同的侧链就构成不同性质的头孢类抗生素。世界上医药工业发达的国家均十分重视7-ACA的研究和生产。
[0003]一步酶法是生产7-ACA的常用技术。头孢菌素C酰化酶(CPC酰化酶，CCA)是一步酶法生产7-ACA的关键酶，能够将原料头孢菌素C(CPC)直接催化，脱去7-位的D-d氨基己二酰侧链，生成7-ACA。作用分子式如下：
[0004][0005]头孢菌素C酰化酶主要靠基因工程菌发酵培养获得。为了提高酶的表达量和活性，研究人员不断尝试筛选发酵性能优越的菌株，或者构建基因工程菌株(内源信号肽DSE4介导头孢菌素C酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达，华东理工大学学报(自然科学版)，2015)。但目前鲜有对发酵工艺改进的报道，主要是因为头孢菌素C酰化酶的发酵过程非常复杂，涉及培养基、发酵温度调节控制(包括温度和对应时间)、补料种类、补料时机、补料速度等诸多条件相互配合，优化获得一个比较好的发酵方法较为困难。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是，提供一种简单、高效的头孢菌素C酰化酶的发酵工艺，具体技术方案包括：
[0007]一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法，包括：
[0008](1)移种：将种子液移入发酵培养基中；
[0009](2)发酵：发酵60h，维持pH值6.8-7.2，第0-7h控制发酵培养温度为37
±
1℃，第8-60h的发酵温度25
±
1℃；期间补料，并调整搅拌速度，控制溶氧量为20％-30％；
[0010]步骤(1)所述发酵培养基含有：酵母膏43.0-48.0g/1、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l；
[0011]步骤(2)所述补料为补加乳糖和甘油；
[0012]所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD
600
≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％
±
0.1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％
±
0.1％的乳糖；
[0013]所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100
±
1L/h；第8-18h，流加补入甘
油75
±
1L/h；第18-30h，流加补入甘油85
±
1L/h；第30-40h，流加补入甘油90
±
1L/h；第40-50h，流加补入甘油95
±
1L/h；第50-60h，流加补入甘油100
±
1L/h。
[0014]如前述的方法，步骤(2)中，第0-7h控制发酵培养温度为37℃，第8-60h的发酵温度25℃。
[0015]如前述的方法，所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD
600
≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％的乳糖。
[0016]如前述的方法，所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100L/h；第8-18h，流加补入甘油75L/h；第18-30h，流加补入甘油85L/h；第30-40h，流加补入甘油90L/h；第40-50h，流加补入甘油95L/h；第50-60h，流加补入甘油100L/h。
[0017]如前述的方法，步骤(1)的菌体接种量为1.25％(v/v)。
[0018]如前述的方法，步骤(1)之前还包括种子制备步骤，所述摇瓶菌种制备的步骤为：
[0019]a.制备摇瓶菌悬液：取出甘油管，自然解冻后接种至无菌摇瓶中的培养基，pH7.0-7.2、37℃条件下摇床培养15-17h；
[0020]b.制备一级种子：将步骤a中的摇瓶菌悬液接种至一级种子罐中的一级培养基，在pH6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h；
[0021]c.制备二级种子：将步骤b的一级种子接种至二级种子罐中的二级培养基，在pH6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h；
[0022]步骤a所述培养基含有蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、氯化钠10g/l；
[0023]步骤b所述一级培养基含有蛋白胨12g/l、酵母膏6g/l、氯化钠10g/l；
[0024]步骤c所述二级培养基含有蛋白胨12g/l、酵母膏6g/l、氯化钠10g/l。
[0025]如前述的方法，步骤(3)之后还包括酶活检测步骤。
[0026]如前述的方法，所述酶活检测步骤为：
[0027]富集发酵菌体，加水定容至原体积，均质后，得到均质液，再使用头孢菌素C作为底物，使用电位滴定的方法测定酶活。
[0028]现有技术(CN105112392A)中，所得发酵产物中，细胞内头孢菌素C酰化酶的活性为5000U/L，即5U/mL。本专利技术的发酵方法，得到的发酵菌体的均质液的头孢菌素C酰化酶活性高达170U/mL以上。
[0029]另外，本专利技术的方法对应补料工艺无需参考发酵液的OD值，节省了由OD值实时监测所产生的成本。
[0030]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0031]以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
具体实施方式
[0032]实施例中使用的生产菌种为BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株，是外源基因表达头孢菌素C酰化酶的重组大肠杆菌。该大肠杆菌表达菌株是以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7RNA聚合酶表达受控于DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21
的染色体上。
[0033]实施例1 CPC酰化酶发酵
[0034]1.方法
[0035](1)制备摇瓶菌悬液
[0036]摇瓶培养基含有：蛋白胨10g/l酵母膏5g/l氯化钠10g/l，生产菌种由甘油管接种至装有摇瓶培养基的无菌摇瓶，在pH7.0-7.2、37℃摇床培养15-17h。
[0037](2)制备一级种子
[0038]一级培养基配比：蛋白胨12g/l酵母膏6g/l氯化钠10g/l，纯种摇瓶菌悬液接种至一级种子罐，在pH6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h。
[0039](3)制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法，其特征在于，包括：(1)移种：将种子液移入发酵培养基中；(2)发酵：发酵60h，维持pH值6.8-7.2，第0-7h控制发酵培养温度为37
±
1℃，第8-60h的发酵温度25
±
1℃；期间补料，并调整搅拌速度，控制溶氧量为20％-30％；步骤(1)所述发酵培养基含有：酵母膏43.0-48.0g/l、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l；步骤(2)所述补料为补加乳糖和甘油；所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD
600
≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％
±
0.1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％
±
0.1％的乳糖；所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100
±
1L/h；第8-18h，流加补入甘油75
±
1L/h；第18-30h，流加补入甘油85
±
1L/h；第30-40h，流加补入甘油90
±
1L/h；第40-50h，流加补入甘油95
±
1L/h；第50-60h，流加补入甘油100
±
1L/h。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，第0-7h控制发酵培养温度为37℃，第8-60h的发酵温度25℃。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述补...

【专利技术属性】
技术研发人员：何锡林，张云辉，李琨，韩原亮，蒋成辉，马利萍，王文静，尹凡钦，原振刚，
申请(专利权)人：伊犁川宁生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：