本发明专利技术公开了一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程技术领域。在本发明专利技术中通过改造信号肽，实现了蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效的胞外表达，解决了蛋白质谷氨酰胺酶胞外分泌不足的问题。本发明专利技术通过改造信号肽，使蛋白质谷氨酰胺酶的分泌酶活由0.44U/mL提高到3.2U/mL，酶活提高7.27倍，应用本发明专利技术中的信号肽明显提高了蛋白质谷氨酰胺酶的胞外分泌，降低了工业上生产蛋白质谷氨酰胺酶的成本，同时也为枯草芽孢杆菌外源分泌蛋白表达量的提高奠定了基础。蛋白表达量的提高奠定了基础。蛋白表达量的提高奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法
[0001]本专利技术涉及一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程
技术介绍
[0002]蛋白质谷氨酰胺酶(protein
‑
glutaminase，EC3.5.1.44，简称PG)是一类特异性谷氨酰胺脱酰胺水解酶。蛋白质谷氨酰胺酶主要应用于食品工业，大量研究验证该酶能显著改善小麦谷蛋白、米谷蛋白等植物蛋白的溶解度、乳化性和起泡性等功能，蛋白质谷氨酰胺酶的脱酰胺作用不需要提前对蛋白质进行预处理且特异性强，只作用于蛋白质的侧链的谷氨酰胺，对天冬酰胺无脱酰胺作用，且不会对蛋白质的结构造成不良变化。但是目前蛋白质谷氨酰胺酶的应用受到制约，其中蛋白分泌表达量低是其中一个重要因素。
[0003]与产蛋白质谷氨酰胺酶的野生解朊金黄杆菌相比，枯草芽孢杆菌作为传统的工业生产菌，具有极强的蛋白质分泌能力，是蛋白质谷氨酰胺酶表达和分泌的良好系统。目前研究表明枯草芽孢杆菌的启动子与信号肽等表达元件的选择与优化对外源蛋白表达有重要影响。其中，信号肽最主要功能就是引导分泌蛋白或膜蛋白，在细胞内不同区域或不同细胞器进行正确定位，可提高外源蛋白质的可溶性，避免因包涵体复性带来的产物纯化等困难。然而信号肽对蛋白的表达分泌往往具有特异性，同一种蛋白质在不同信号肽的作用下，表达分泌效率往往相差甚远，缺乏普适应的规律。
[0004]因此，获得高效、特异性的信号肽序列，改善蛋白质谷氨酰胺酶蛋白分泌途径，提高蛋白质谷氨酰胺酶表达效率，是很有难度的事情，但具有重要的应用价值。
技术实现思路
[0005]本专利技术提供一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，所述方法包括：以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列如GenBank登录号：AB046594.1所示，编码所述蛋白质谷氨酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.1所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。编码SEQ ID NO.2所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。编码SEQ ID NO.3所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。编码SEQ ID NO.4所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。编码SEQ ID NO.5所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。编码SEQ ID NO.6所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。编码SEQ ID NO.7所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。编码SEQ ID NO.8所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述分泌表达是通过构建重组菌实现。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是以细菌为宿主。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是重组枯草芽孢杆菌。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的出发菌株为枯草芽孢杆菌WB600。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌WB600为出发菌株，将SEQ ID NO.9所示基因编码的蛋白质谷氨酰胺酶基因N端融合核苷酸序列为SEQ ID NO.22～29所示的信号肽形成的重组基因进行表达。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供一种重组菌，所述重组菌以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是重组枯草芽孢杆菌。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，在编码蛋白质谷氨酰胺酶基因的N端融合SEQ ID NO.1～8任一所示的信号肽，得到重组基因，并将该重组基因与表达质粒pP43NMK连接所构成的重组质粒转化到大肠杆菌JM109中，抽提质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列如GenBank登录号：AB046594.1所示；编码蛋白质谷氨酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组基因是采用基因合成和一步克隆法得到的含有改造信号肽和蛋白质谷氨酰胺酶基因序列的重组基因。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法如下：合成SEQ ID NO.22～29任一所示的信号肽，分别通过一步克隆的方法将每条信号肽的DNA片段与插入到目的载体的RBS之后，RBS序列如SEQ ID NO.21所示，得到重组质粒，转入E.coli JM109中，经质粒的抽提后导入宿主菌细胞中，得到重组枯草芽孢杆菌。
[0019]本专利技术另外提供了一种生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法，是使用上述的重组菌进行发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶。可选地，所述重组菌为重组枯草芽孢杆菌。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌于37℃培养36h。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基发酵。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述接种是按体积接种4％的种子液。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述种子液是将所述重组菌接种于LB培养基中，于37℃，220rpm培养8～12h，获得种子液。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是先进行种子培养，再进行发酵；所述种子培养是将所构建好的重组质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中，现用现转。从平板上挑取枯草芽孢杆菌单菌落，接种至装液量为25mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，220r/min培养8～12h，所述摇瓶发酵是将培养10h的种子液以4％(V/V)的接种量接入含50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，装液量为25mL/250mL，37℃，220r/min培养36h。
[0025]本专利技术还要求保护所述重组菌在食品、生物领域的应用。
[0026]本专利技术还要求保护SEQ ID NO.8所述的信号肽(YdeJ)在提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达效果或在蛋白质谷氨酰胺酶生产方面的应用。
[0027]有益效果：
[0028]在本专利技术中通过改造信号肽，实现了蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效的
胞外表达，解决了蛋白质谷氨酰胺酶胞外分泌不足的问题。本专利技术通过改造信号肽，使蛋白质谷氨酰胺酶的分泌酶活由0.44U/mL提高到3.26U/mL，酶活提高7.4倍，应用本专利技术中的信号肽明显提高了蛋白质谷氨酰胺酶的胞外分泌，降低了工业上生产蛋白质谷氨酰胺酶的成本，同时也为枯草芽孢杆菌外源分泌蛋白表达量的提高奠定了基础。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，其特征在于，所述方法包括：以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列如GenBank登录号：AB046594.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分泌表达是通过构建重组菌实现。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌是以细菌为宿主。5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是重组枯草芽孢杆菌；所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，在编码蛋白质谷氨酰胺酶基因的N端融合SEQ ID NO.1～8任一所示的信号肽...
【专利技术属性】
技术研发人员：张国强，堵国成，殷鑫鑫，周景文，陈坚，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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