一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其应用。所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)d3的酰胺酶基因经过突变得到，野生型酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体由野生型酰胺酶经过R94P、I97L、S177C或G195A中的至少一个位点突变所得。发明专利技术筛选得到来自Agrobacterium tumefaciens d3的酰胺酶，在乙醇浓度0％

【技术实现步骤摘要】
一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate；C2H5OCONH2)，简称EC。氨基甲酸乙酯是化工生产的重要原料，具有广泛的用途，其具有麻醉神经的作用，在医疗上用作镇静及缓和的催眠药。氨基甲酸乙酯也广泛存在于传统的发酵食品泡菜、酱油、醋和酒精饮料清酒、葡萄酒、黄酒中。1943年EC的潜在致癌作用被Nettleship等人通过研究发现，1974年国际癌症研究机构(IARC)将EC划分为2B级致癌物，2007年IARC正式将EC的致癌级别由2B类提高为2A类。实验证明氨基甲酸乙酯对所有实验动物具有致癌性，对人有潜致癌性。为了解除氨基甲酸乙酯对食品安全的危害，目前主要是通过原料修改，发酵工艺优化，发酵酒中EC前体的运输调节以及添加酸性脲酶来降低EC含量。但是，由于EC有许多前体，例如尿素，瓜氨酸，精氨酸，氢氰酸，碳酸二乙酯2-4，上述方法不能完全避免EC的形成，且对已经形成的EC没有降解作用，因此使用氨基甲酸乙酯水解酶是降解EC的最直接，最有效的方法。
[0003]氨基甲酸乙酯水解酶(EC 3.5.1.75)能将EC催化为乙醇，二氧化碳和氨(图1)，是降解EC最直接有效的办法。目前筛选得到的氨基甲酸乙酯水解酶对乙醇的耐受性差，对酸的耐受性差，对EC的亲和力低。其中现筛选得到的耐乙醇能力高的菌株分别是Micrococcus sp.在20％的乙醇浓度下，保留82％酶活(Mohapatra,B.R.；Bapuji,M.,Characterization of urethanase from Micrococcus species associated with the marine sponge(Spirastrella species).Lett.Appl.Microbiol.1997,25(6),393-396.)和Candida parapsilosis在20％的乙醇浓度下，保留73％酶活(Masaki,K.；Mizukure,T.；Kakizono,D.；Fujihara,K.；Fujii,T.；Mukai,N.,New urethanase from the yeast Candida parapsilosis.Journal of bioscience and bioengineering 2020.)。由于氨基甲酸乙酯水解酶主要用于发酵酒中，但是传统的发酵酒酒精浓度在20％左右，呈酸性；因此目前筛选得到的氨基甲酸乙酯水解酶适用性不高。

技术实现思路

[0004]针对现发现的氨基甲酸乙酯水解酶存在的问题，本专利技术的目的在于筛选得到一株耐乙醇且具有高活力的氨基甲酸乙酯水解酶，并且对其催化活性进行改造。
[0005]一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体，由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)d3的酰胺酶基因经过突变得到，野生型酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体由野生型酰胺酶经过R94P、I97L、S177C或G195A中的至少一个位点突变所得。优选的，所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体由野生型酰胺酶经过以下任意一种突变所得：G195A/R94P、G195A/S177C、I97L/S177C或I97L/G195A。
[0006]本专利技术又提供了编码所述的氨基甲酸乙酯水解酶突变体的基因。
[0007]本专利技术又提供了所述的氨基甲酸乙酯水解酶突变体或所述的基因在催化水解氨基甲酸乙酯中的应用。
[0008]本专利技术还提供了一种水解氨基甲酸乙酯的方法，使用所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体催化水解氨基甲酸乙酯。优选的，催化水解时的pH为6.5～8.5，温度为40℃-65℃。更优选的，pH为7～7.5，温度为50～55℃。优选的，催化水解时体系中乙醇浓度为不高于25％。更优选的，催化水解时体系中乙醇浓度为不高于20％。进一步优选的，催化水解时体系中乙醇浓度为不高于10％。
[0009]本专利技术筛选得到来自Agrobacterium tumefaciens d3的酰胺酶，在pH7.5时具有最高酶活，在pH 7.5，37℃时，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活高达473U/L。在pH6.5-8.5的范围内，展现出相对较高的酶活力，其残余酶活大于70％。该酶经过镍柱纯化之后，比酶活为0.62mg/mL，在乙醇浓度0％-20％之间，剩余酶活高于90％，高于25％之后酶活下降迅速，该酶对低浓度乙醇表现出极好的耐受性。通过半理性改造，构建了一个21个点突变的突变体库，并从中筛选得到4个酶活有提高的突变位点(R94P、I97L、S177C、G195A)，组合突变株I97L/G195A酶活提高了5.2倍，由原来的395U/L提高到2442U/L。
附图说明
[0010]图1为氨基甲酸乙酯水解酶的反应方程式。
[0011]图2为氨基甲酸乙酯水解酶的最适pH检测结果图。
[0012]图3为氨基甲酸乙酯水解酶的最适温度检测结果图。
[0013]图4为乙醇浓度对氨基甲酸乙酯水解酶活性影响检测结果图。
[0014]图5为氨基甲酸乙酯水解酶的活性中心图。
[0015]图6为氨基甲酸乙酯水解突变位点对催化活力的影响检测结果图。
[0016]图7为突变酶与野生酶的最适pH比较结果图。
[0017]图8为突变酶与野生酶的最适温度比较结果图。
[0018]图9为乙醇浓度对突变酶与野生酶活性影响比较结果图。
[0019]图10为突变酶与野生酶的温度稳定性比较结果图。
具体实施方式
[0020]实施例1：Agrobacterium tumefaciens d3酰胺酶异源表达
[0021](1)用引物序列D
3-F，D
3-R(表1)扩增根癌农杆菌d3的酰胺酶基因(委托擎科生物合成，基因序列为GenBank：AF315580，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)，用引物pET30-F，pET30-R扩增得到线性化载体。然后使用ClonExpress II一步克隆试剂盒(购自诺唯赞公司，货号C112-02)将基因片段连接至载体的NdeI、HindIII两个位点之间。构建的质粒命名为pET-30a(+)/AtUTNase。所构建质粒上的基因具有His-tag，便于纯化。
[0022]表1引物
[0023][0024][0025](2)将质粒pET-30a(+)/AtUTNase转化大肠杆菌BL21(DE3)，将携带pET-30a(+)/AtUTNase的大肠杆菌BL21(DE3)接种含有卡那霉素的试管中培养过夜后，转接到50mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，在37℃的振荡器上孵育。当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG终浓度为0.5mM，18℃诱导表达18h。
[0026](3)培养好的菌体4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体，其特征在于，由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)d3的酰胺酶基因经过突变得到，野生型酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体由野生型酰胺酶经过R94P、I97L、S177C或G195A中的至少一个位点突变所得。2.如专利要求1所述的氨基甲酸乙酯水解酶突变体，其特征在于，所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体由野生型酰胺酶经过以下任意一种突变所得：G195A/R94P、G195A/S177C、I97L/S177C或I97L/G195A。3.编码如权利要求1或2所述的氨基甲酸乙酯水解酶突变体的基因。4.如权利要求1或2所述的氨基甲酸乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴绵斌，康婷婷，杨祎，林建平，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：