一种从红刀豆中提取脲酶的方法技术

本发明专利技术属于生物蛋白提取技术领域，具体涉及一种从红刀豆中提取脲酶的方法，方法包括如下步骤：称取红刀豆研磨成粉，筛分后加入提取液，将红刀豆粉末和提取液充分搅拌，在室温下离心，收集上清液A，上清液A滤纸抽滤，得到上清液B；在上清液B加入60％PEG4000，在4℃温度下静置，离心，收集沉淀；将沉淀加入重悬液，重悬溶解后离心，收集上清并抽滤，得到溶液A；先用HCl将溶液A调为pH＝5.1，再用NaOH将溶液调为pH＝6.0，得到溶液B；将溶液B加入至柠檬酸

【技术实现步骤摘要】
一种从红刀豆中提取脲酶的方法


[0001]本专利技术属于生物蛋白提取
，具体涉及一种从红刀豆中提取脲酶的方法。

技术介绍

[0002]脲酶是一种十分重要的生物制剂，广泛分布于植物的种子中，以大豆和刀豆中的含量最高。脲酶是一种寡聚酶，可以催化尿素水解释放氨和二氧化碳，催化效率比无脲酶存在下的速率高出1000多倍，脲酶被广泛的应用于农业，医药行业等领域：在韩国，它被用于治疗呕吐、腹部浮肿、肾脏相关腰痛，在日本，它对治疗脓溢、中耳炎、疖子和癌症、各种炎症性疾病和特应性皮炎有效，在中国，脲酶被用于处理动物排泄物，防止空气污染，同时脲酶还可以处理含有尿素的废水，符合了中国当今绿色化学的要求。随着我国经济发展，固定化脲酶技术的进步，对脲酶的需求越来越大。
[0003]我国的豆类资源十分丰富，而目前国内针对脲酶提取的研究报告主要集中在大豆，黄豆等植物中提取和纯化，崔有宏等人在“黄豆脲酶的提取与性质研究”一文中采用醋酸盐缓冲液对黄豆粉进行提取，然后通过亚硫酸钠盐析，其沉淀再经磷酸盐缓冲液溶解，透析，DEAE
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纤维素柱色谱分离，洗脱液冷冻干燥后得到脲酶产品。但是该工艺流程复杂，脲酶损失严重，成本较高。Hsien
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Yi Sung等人在“A Procedure for Purifying Jack Bean Urease for Clinical Use”中提到了一种纯化尿素酶的方法，采用20％丙酮(含1mM EDTA和1mM巯基乙醇)进行提取，离心，清液调节丙酮浓度至31
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35％，然后再经氢氧化钠碱化，再40℃热处理5min，离心，清液用柠檬酸调节至等电点附近，离心收集沉淀，再用磷酸盐缓冲液中和后冷冻干燥即可得脲酶。该方法虽然可以得到纯度较高的蛋白，但是使用了丙酮危险试剂，且实验过程危险。
[0004]红刀豆脲酶对比洋豆类脲酶丙酮提取来说，其原材料红刀豆易获得，红刀豆主要分布在中国的南部且产量十分丰富，且实验过程不需要丙酮危险试剂，对比大豆，黄豆脲酶提取来说，提取红刀豆脲酶的优势在于过程路线简单，提取的脲酶纯度较高。目前以红刀豆为原料的提取技术研究较少，使用该种方法提取脲酶，原料、提取试剂易获得，提取的脲酶纯度高，具有工业化生产的前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种从红刀豆中提取脲酶的方法，该方法工艺流程简单，操作时间短，条件温和，无需使用危险试剂，得到的脲酶纯度超过80％，活性好且回收率高，具有稳定的工业前景。
[0006]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术是通过以下技术方案实现：
[0007]一种从红刀豆中提取脲酶的方法，包括如下步骤：
[0008]1)提取：称取红刀豆研磨成粉，筛分后加入提取液，28℃下将红刀豆粉末和提取液充分搅拌，使得红刀豆粉末中脲酶全部浸提，然后将浸提液在室温下离心，收集上清液A，上清液A滤纸抽滤，得到上清液B；
[0009]2)粗沉淀：在得到的上清液B加入60％PEG4000，在4℃温度下静置，离心，收集沉淀；
[0010]3)重悬：将得到的沉淀加入重悬液，重悬溶解后离心，收集上清并抽滤，得到溶液A；
[0011]4)调整pH值：先用HCl将得到的溶液A调为pH＝5.1，离心，收集上清，再用NaOH将溶液调为pH＝6.0，得到溶液B；
[0012]5)冻干：将得到的溶液B加入至柠檬酸
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柠檬酸钠中进行透析，在4℃温度下静置，离心，抽滤，收集上清，冻干。
[0013]进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤1)中，提取液是50mM柠檬酸
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柠檬酸钠+3％PEG4000溶液，红刀豆粉末和提取液按照150
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250g:1L的料液比进行混合。
[0014]进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤1)中，红刀豆研磨成粉后，用振动筛进行筛分，以除去颗粒度较大的不溶性杂质，红刀豆粉末和提取液采用磁力搅拌，搅拌时间为20
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40min；离心转速为9000
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10000rpm，离心时间为8
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12min。
[0015]进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤2)中，60％PEG4000溶液采用滴加方式缓慢加入，终浓度为10％。
[0016]进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤2)中，离心温度为3
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5℃，离心转速为9000
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10000rpm，离心时间为18
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22min。
[0017]进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤3)中，重悬液的成分为50mM柠檬酸
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柠檬酸钠、5mg/ml甘氨酸、5mg/ml葡萄糖、30mg/ml山梨醇。
[0018]进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤3)中，离心温度为7
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9℃，离心转速为9000
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10000rpm，离心时间为25
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35min。
[0019]进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤4)中，先用10％的HCl将得到的溶液A调为pH＝5.1，离心，收集上清，在用6MNaOH将溶液调为pH＝6.0，得到溶液B。
[0020]进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤4)中，离心温度为16
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20℃，离心转速为9000
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10000rpm，离心时间为25
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35min。
[0021]进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤5)中，使用10mM柠檬酸钠进行透析，透析完后离心，离心条件为4℃、9500rpm，30min；上清使用0.45μM滤膜抽滤，抽滤后液体进行冷冻干燥。
[0022]本专利技术的有益效果是：
[0023]1、本专利技术采用红刀豆为原料，红刀豆主产地在中国，原料易获得，以柠檬酸
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柠檬酸钠作为缓冲溶液体系，其缓冲能力强，且不影响蛋白质活性，能够保持蛋白质结构稳定。整个工艺流程步骤较少，耗时时间较短，且不需要在提取剂中添加丙酮溶液，反应温和，经过聚乙二醇沉淀、等电点沉淀，使得大部分的杂蛋白被析出，最终得到蛋白浓度为80％的脲酶。
[0024]2、本专利技术方法操作简单，工艺流程短，能耗低，反应温和，解决了反应时间和反应危险的问题，提取过程中采取了常规的固液分离方式，是一种具有工业应用价值的提取方法。
[0025]当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从红刀豆中提取脲酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提取：称取红刀豆研磨成粉，筛分后加入提取液，28℃下将红刀豆粉末和提取液充分搅拌，使得红刀豆粉末中脲酶全部浸提，然后将浸提液在室温下离心，收集上清液A，上清液A滤纸抽滤，得到上清液B；2)粗沉淀：在得到的上清液B加入60％PEG4000，在4℃温度下静置，离心，收集沉淀；3)重悬：将得到的沉淀加入重悬液，重悬溶解后离心，收集上清并抽滤，得到溶液A；4)调整pH值：先用HCl将得到的溶液A调为pH＝5.1，离心，收集上清，再用NaOH将溶液调为pH＝6.0，得到溶液B；5)冻干：将得到的溶液B加入至柠檬酸
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柠檬酸钠中进行透析，在4℃温度下静置，离心，抽滤，收集上清，冻干。2.根据权利要求1所述的从红刀豆中提取脲酶的方法，其特征在于：步骤1)中，提取液是50mM柠檬酸
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柠檬酸钠+3％PEG4000溶液，红刀豆粉末和提取液按照150
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250g:1L的料液比进行混合。3.根据权利要求1所述的从红刀豆中提取脲酶的方法，其特征在于：步骤1)中，红刀豆研磨成粉后，用振动筛进行筛分，以除去颗粒度较大的不溶性杂质，红刀豆粉末和提取液采用磁力搅拌，搅拌时间为20
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40min；离心转速为9000
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10000rpm，离心时间为8
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12min。4.根据权利要求1所述的从红刀豆中提取脲酶的方法，其特征在于：步骤2)中，60％PEG4000溶液采用滴加方式缓慢加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：李婷婷，朱海，贾玮玮，
申请(专利权)人：伊势久江苏连云港生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：