一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种N

【技术实现步骤摘要】
一种N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的提取方法


[0001]本专利技术涉及一种N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的提取方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]D
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葡萄糖胺在人体内具有重要的生理意义，应用于医药、食品和化妆品等领域。甲壳素广泛分布于虾壳、蟹壳等生物原料中，但生产过程需要使用强酸和强碱，易造成严重的环境污染。利用基因工程技术可以构建生产N
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乙酰氨基葡萄糖的重组微生物，可以实现N
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乙酰氨基葡萄糖的大规模生产，但距离D
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葡萄糖胺仍有一步之遥，需要N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶催化水解后才能得到。
[0003]N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(EC 3.5.1.33)是一种重要的脱乙酰酶，分子量为30～60kDa，一些酶复合体的分子量在160～200kDa之间。催化的生物反应式为：N
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乙酰
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D
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葡萄糖胺+H2O＝D
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葡萄糖胺+乙酸。Roseman于1957年首次发现该酶催化和参与D
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葡萄糖胺的代谢过程。同族中相近功能的脱乙酰酶还包括甲壳糖脱乙酰酶(EC 3.5.1.41)，二乙酰壳二糖脱乙酰酶(EC 3.5.1.105)和N
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乙酰氨基葡糖
‑6‑
磷酸脱乙酰酶(EC 3.5.1.25)。目前已发现的存在N
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>乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的微生物主要有大肠杆菌、乳酸乳球菌、柯达卡热球菌、堀越热球菌等(J.Biol.Chem.2004,279,30021
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30027)。通过重组大肠杆菌、重组枯草芽孢杆菌等微生物经过好氧发酵可实现高效表达和生产得到。提取N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶是生产D
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葡萄糖胺的关键步骤之一。
[0004]1993年美国专利(US 5219749)公开了一种纯化甲壳糖脱乙酰酶的方法，利用硫酸铵沉淀法富集鲁氏毛霉发酵液中的甲壳糖脱乙酰酶，再依次经过疏水色谱、强阴离子交换色谱和强阳离子交换色谱三个单元，最终得到较纯的甲壳糖脱乙酰酶。
[0005]2002年希腊克里特大学Bouriotis等从酿酒酵母中提取出甲壳糖脱乙酰酶，其提取步骤主要包括：以硫酸铵沉淀法富集粗酶后，加入到苯基
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SepharoseHiLoad(疏水)色谱柱，梯度洗脱后再载入到Mono S阳离子交换色谱柱上分离，最终得到较纯的甲壳糖脱乙酰酶，回收率24.5％。
[0006]2006年武汉大学蔡军利用短柄帚霉好氧发酵获得甲壳糖脱乙酰酶，利用硫酸铵沉淀法富粗酶，再依次经过Sephadex G
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25和Sephadex G
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100两个色谱单元，最终得到较纯的甲壳糖脱乙酰酶。
[0007]2012年美国专利(US2012009627A1)和中国专利(CN 105039464A)公布了N
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乙酰氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸脱乙酰基酶(EC 3.5.1.25)、N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶(EC 3.5.1.33)、壳多糖脱乙酰酶和酰基转移酶的基因修饰、发酵工艺和酶反应条件。
[0008]酶提取效率的高低一方面取决于原料中杂质的成分组成、目标物和杂质的理化性质差异、目标产物的相对浓度等因素。目前关于N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶提取方法的公开文献比较少，与之性质和功能相近的甲壳糖脱乙酰酶则相对较多，但仍主要是在实验室规模下实现，基本步骤包括盐沉析富集和多级色谱纯化，分离步骤多，提取相关的材料昂
贵，且分离过程使用的试剂通常为有机溶剂，不利于绿色安全生产，且最终产品的回收率较低。

技术实现思路

[0009]针对现有技术存在的高物耗、低效率等缺陷，本专利技术提供了一种新的N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶提取方法，以富含N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的重组微生物发酵液为原料，通过陶瓷膜微滤或絮凝沉淀实现固液分离，收集得到微生物菌体并同时去除培养基中残留的营养物等细胞外杂质；利用高压均质法使细胞壁破裂，释放出包含有N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的细胞内容物；最后采用陶瓷微滤膜或陶瓷超滤膜截留细胞碎片等，使N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶透析出来，得到较纯的酶溶液。
[0010]本专利技术的第一个目的是提供一种N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的分离纯化方法，所述方法包括如下步骤：
[0011](1)以含有N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的微生物发酵液为原料，采用陶瓷微滤膜浓缩法或者絮凝离心法实现固液分离，得到内含有N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的微生物浓悬液；
[0012](2)将微生物浓悬液进行高压均质处理，使微生物细胞壁破裂并从细胞内释放出N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，得到含有N
‑
乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的破壁悬液；
[0013](3)将破壁悬液经过陶瓷微滤膜或陶瓷超滤膜分离，透出液中得到纯度较高的N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶提取液。
[0014]在一种实施方式中，所述步骤(1)中的微生物发酵液是微生物在含碳源、氮源和无机盐的培养基中发酵一段时间后的发酵液，含有N
‑
乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶、细胞代谢物和未消耗完全的培养基成分；所述微生物发酵液可以是重组大肠杆菌发酵液，也可以是重组枯草杆菌发酵液，也可以是乳球菌发酵液，也可以是重组酵母发酵液。
[0015]在一种实施方式中，所述述步骤(1)中的微滤膜是陶瓷材质的膜组件，所述微滤膜的平均孔径为1
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5μm，操作压力为0.3～0.8MPa，操作过程的温度控制在4～30℃。
[0016]在一种实施方式中，所述步骤(1)所用的絮凝剂是食品安全的絮凝剂，包括但不限于有机絮凝剂或无机絮凝剂；
[0017]在一种实施方式中，所述絮凝剂是聚丙烯酰胺、二甲基胺
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表氯醇共聚物、聚合氯化铁、氯化铁、硫酸铁、硫酸亚铁中的一种或两种以上的组合；
[0018]在一种实施方式中，所述絮凝剂的添加方式为(a)或(b)：
[0019](a)按如下剂量添加单一组分的絮凝剂：聚丙烯酰胺的添加量为原料中生物量干重的0.01～0.2％；二甲基胺
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表氯醇共聚物的添加量为生物量干重的0.01～0.1％；聚合氯化铁的添加量为生物量干重的0.1～2.0％；氯化铁的添加量为生物量干重的0.1～1.0％；硫酸铁的添加量为生物量干重的0.1～1.5％；硫酸亚铁的添加量为生物量干重的0.2～2.0％；
[0020](b)添加含有两种以上组分的絮凝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以含有N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的微生物发酵液为原料，采用陶瓷微滤膜浓缩法或者絮凝离心法实现固液分离，得到内含有N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的微生物浓悬液；(2)高压均质处理步骤(1)收集的微生物浓悬液，收集含有N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的破壁悬液；(3)将步骤(2)获得的破壁悬液经过陶瓷微滤膜或陶瓷超滤膜分离，收集透出液中的N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶提取液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的微生物发酵液可以是重组大肠杆菌发酵液，也可以是重组枯草杆菌发酵液，也可以是乳球菌发酵液，也可以是重组酵母发酵液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的微滤膜是陶瓷材质的膜组件，所述微滤膜的平均孔径为1～5μm，操作压力为0.3～0.8MPa，操作过程的温度控制在4～30℃。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用于步骤(1)所述絮凝的絮凝剂是食品安全的絮凝剂，包括但不限于有机絮凝剂或无机絮凝剂。5.根据权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁春华，章文劼，
申请(专利权)人：拜启私人有限公司，
类型：发明
国别省市：