几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体制造技术

本发明专利技术涉及几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体，为三维立体结构，所述晶体具有空间P212121，晶胞参数为所述几丁质脱乙酰基酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术通过晶体结构解析和结构分析获得的结构信息，可进行抗菌剂设计，在防治植物土传真菌病害领域具有广阔的应用前景。真菌病害领域具有广阔的应用前景。真菌病害领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]植物土传病原真菌病害造成农作物减产，甚至绝产，严重威胁着我国农业生产和社会经济稳定，目前还没有针对性的高效绿色抗菌剂。几丁质脱乙酰基酶是病原真菌逃避植物免疫的一个关键致病因子，植物土传致病真菌通过分泌几丁质脱乙酰基酶对细胞壁重要结构成分几丁质进行脱去乙酰基团的修饰，从而逃避几丁质诱发的植物免疫识别。几丁质脱乙酰基酶活性缺失会使病原真菌丧失致病性，并且在人和植物中不存在同源蛋白，因此利用小分子化合物抑制几丁质脱乙酰基酶活性可能是防治病原真菌的绿色有效策略。
[0003]随着结构生物学和虚拟筛选技术的发展，基于结构的筛选和设计已经成为抑制剂开发重要途径。2013年Lamberth等人在《Science》上发表的文章《Current challenges and trends in the discovery of agrochemicals》明确指出：“Structure
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based design is a growing discipline within crop protection research”(基于靶标结构的农药设计是作物保护领域中的一门新兴学科)。因此，植物土传病原真菌几丁质脱乙酰基酶的晶体结构对于进一步基于结构信息筛选获得高效的抑制剂至关重要，是基于靶标的新药开发的核心基础和重要依据。然而，目前尚未有植物土传病原真菌几丁质脱乙酰基酶的结构被报道，极大地限制了植物抗菌剂的开发。

技术实现思路

[0004]鉴于现有技术的需求，本专利技术提供一种植物土传致病真菌的关键致病蛋白几丁质脱乙酰基酶晶体，通过晶体结构解析和结构分析获得的结构信息，可进行抗菌剂设计，在防治植物土传真菌病害领域具有广阔的应用前景。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006]几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体，为三维立体结构，所述晶体具有空间P212121，晶胞参数为所述几丁质脱乙酰基酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]所述晶体的一个不对称单位中有五个分子。
[0008]所述晶体具有(β/α)7桶状结构。
[0009]所述晶体的活性中心具有一个锌离子，其与Asp56、His108、His112形成金属三联体结构。
[0010]所述晶体的底物结合口袋附近具有6个环状结构，构成了短且深的呈电负性的底物结合裂缝，并且在底物结合裂缝分布了四个疏水的芳香族氨基酸，形成了
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1、0、+1、+2四个底物结合位点。
[0011]涉及的环状结构序列为KNFGELKNYV、HTWDHPYLTQLS、RPPYFDYNAKT、HADLDTNDWKFD、
GVANNR、VHETTV。
[0012]所述的芳香族氨基酸为Phe85、Phe150、His168、Trp177。
[0013]所述蛋白晶体的制备方法，包括：(1)将纯化的蛋白在pH7.4的0.02M Tris、0.1M氯化钠缓冲液中浓缩至10mg/mL；(2)在4℃条件下，采用悬滴扩散法形成几丁质脱乙酰基酶的蛋白晶体；所述几丁质脱乙酰基酶晶体形成条件为：将1μL蛋白溶液置于1μL池液的液滴中生长，所述池液的组成为pH 6.8的0.1M丙二酸钠、0.1M Hepes缓冲液、0.7％v/v聚醚胺ED
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2001。
[0014]该生长条件尤其适用于大丽轮枝菌几丁质脱乙酰基酶VdPDA1蛋白晶体的生长。
[0015]所述蛋白晶体的在筛选几丁质脱乙酰基酶抑制剂以及抗真菌剂中的应用。
[0016]所述真菌为大丽轮枝菌。
[0017]本专利技术以大丽轮枝菌几丁质脱乙酰基酶VdPDA1为对象，提供了一种基于亲和层析、离子交换和凝胶筛分三步法的高效、普适的重组蛋白表达制备方法，获得高纯度蛋白。
[0018]本专利技术提供了能够获得形成完美晶形结晶条件的筛选方法，经X射线衍射蛋白晶体、衍射数据积分、分子置换解析相位等步骤，获得蛋白结构信息，揭示了该蛋白具有(β/α)7桶状结构，底物结合口袋附近具有6个环状结构，构成了短且深的呈电负性的底物结合裂缝，并且在底物结合裂缝分布了四个疏水的芳香族氨基酸，形成了
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1、0、+1、+2四个底物结合位点。涉及的环状结构序列为KNFGELKNYV、HTWDHPYLTQLS、RPPYFDYNAKT、HADLDTNDWKFD、GVANNR、VHETTV，芳香族氨基酸为Phe85、Phe150、His168、Trp177。
[0019]本专利技术的晶体具有四个底物结合位点，可用于抑制剂化合物的筛选。
[0020]本专利技术还提供了基于结构信息进行抑制剂筛选的方法，为今后基于该蛋白结构的抗菌剂设计以及相关的分子作用机制提供核心基础。包括：根据蛋白晶体结构，通过计算机虚拟筛选可能结合到底物结合位点的小分子化合物，以几丁质脱乙酰基酶为靶点进行化合物分子对接，选择打分最高的部分化合物进行抑制活性的评价，通过生物学实验确定所述化合物在防治植物病原真菌中的应用。该筛选方法得到的化合物再次进行生物活性检测，表明筛选得到的化合物与实测结果相符，基于该蛋白结构的抗菌剂设计具有广泛的应用前景。
附图说明
[0021]图1 VdPDA1重组蛋白纯化结果，
[0022]其中，从左到右分别代表蛋白marker、亲和层析收集目的蛋白样品、离子交换收集目的蛋白样品、凝胶筛分收集目的蛋白样品。
[0023]图2条件优化后所得的高质量晶体，
[0024]图3一个不对称单位中VdPDA1蛋白晶体结构，
[0025]图4 VdPDA1活性中心金属三联体结构，
[0026]图5形成VdPDA1底物结合口袋的六个环状结构，
[0027]图6 VdPDA1底物结合口袋结构，
[0028]图7 VdPDA1底物结合位点结构，
[0029]图8 1mM化合物4对大丽轮枝菌侵染棉花幼苗的抗菌活性结果，其中左图为对照组，叶片枯萎，右图为实验组，叶片无枯萎现象，正常生长。
具体实施方式
[0030]下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本专利技术的保护范围。
[0031]实施例中所用试剂均为市售。
[0032]HEPES:4
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羟乙基哌嗪乙磺酸，配制成缓冲液。
[0033]聚醚胺ED
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2001，商品ED
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2001。
[0034]本专利技术选取的植物土传致病真菌大丽轮枝菌几丁质脱乙酰基酶VdPDA1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体，为三维立体结构，所述晶体具有空间P212121，晶胞参数为所述几丁质脱乙酰基酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的蛋白晶体，所述晶体的一个不对称单位中有五个分子。3.根据权利要求1所述的蛋白晶体，所述晶体具有(β/α)7桶状结构。4.根据权利要求1所述的蛋白晶体，所述晶体活性中心具有一个锌离子，其与Asp56、His108、His112形成金属三联体结构。5.根据权利要求1所述的蛋白晶体，所述晶体的底物结合口袋附近具有6个环状结构，构成了短且深的呈电负性的底物结合裂缝，并且在底物结合裂缝分布了四个疏水的芳香族氨基酸，形成了
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1、0、+1、+2四个底物结合位点。6.根据权利要求4所述的蛋白晶体，涉及的环状结构序列为KNFGELKNYV、HTWDHPYLTQLS、RPPYFDYNAKT、HADLDTNDWKFD、GVANNR...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨青，刘霖，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：