一株几丁质合酶转录调控基因MedA失活的黑曲霉基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株几丁质合酶转录调控基因MedA失活的黑曲霉基因工程菌及其应用。本发明专利技术通过基因敲除手段构建了一株几丁质合酶转录调控基因MedA缺失的黑曲霉基因工程菌。该基因工程菌使黑曲霉在固定化发酵产柠檬酸过程中生物膜量减少，使载体孔径被堵死的现象得到有效缓解，增加了载体与外界的传氧传质效果，从而发挥出固定化发酵的优势，提高了柠檬酸的产量，缩短了发酵周期，有效解决了现有工业上黑曲霉发酵生产柠檬酸时产量低、发酵周期长的问题。问题。问题。

【技术实现步骤摘要】
一株几丁质合酶转录调控基因MedA失活的黑曲霉基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一株几丁质合酶转录调控基因MedA失活的黑曲霉基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]柠檬酸作为生物化工产品中的第一大酸，被广泛应用于食品、医药、日化等行业，是目前全世界需求量最大，用途最广泛的有机酸之一。我国是柠檬酸的主要生产国，年产量占到世界总产量的53％。目前，国内生产柠檬酸的菌株主要是丝状真菌黑曲霉，底物主要是木薯粉、玉米粉等粮食粗加工产品。近些年来，由于我国粮食价格，人工成本普遍上涨，随之而来的就是柠檬酸生产成本的大幅上涨。但是，由于国际市场上的柠檬酸产品竞争激烈，成本上涨使国内的柠檬酸市场处境变得越来越困难。
[0003]近几十年来，柠檬酸的工业化生产主要以液态深层发酵模式为主。然而液态深层发酵存在耐受性差、易失活，易衰老、催化时效短等天然缺陷，会使黑曲霉的细胞增殖与分化能力逐渐发生衰退，自溶现象严重，无法被长时间连续地使用，从而导致了发酵过程中大量菌体残渣的积累，造成了营养物质的浪费和底物转化率低的问题。这也是目前柠檬酸行业生产技术的主要瓶颈之一。基于生物膜的细胞固定化发酵技术可以使发酵连续不断进行，缩短生产周期并提高产量，极大提高柠檬酸发酵的效率的同时也降低了成本。在此环境下细胞可以大规模高密度集聚、并具有自增殖和自修复的智能特征、质热传递系统生态高效、反应过程可长期持续进行的特性。此理念和方法克服了以往采用聚乙烯醇凝胶包埋和戊二醛交联等方法将细胞固定于载体上的缺陷，同时也克服了深层液态发酵细胞在液相中自溶现象严重、菌体密度提升受限的问题。对于丝状真菌来说，吸附法操作简单，固定过程中只有物理作用，不存在化学变化，理论上可用于所有丝状真菌的细胞固定，有利于工业化的大规模应用。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株黑曲霉基因工程菌。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述黑曲霉基因工程菌的构建方法。
[0006]本专利技术进一步要解决的技术问题是提供上述黑曲霉基因工程菌在产柠檬酸中的应用。
[0007]为了解决上述第一个技术问题，本专利技术公开了一株黑曲霉基因工程菌，该菌株中几丁质合酶转录调控基因MedA失活。
[0008]其中，所述黑曲霉基因工程菌通过双交换方法，利用hyg抗性基因(潮霉素抗性基因)替换掉基因MedA部分序列的基因工程菌，转录调节基因MedA可以激活黑曲霉中几丁质合酶A、B、C基因的表达，生成几丁质并分泌到胞外，是胞外基质的重要组成部分。敲除了
MedA基因会导致几丁质合酶A、B、C基因无法被激活，导致几丁质的合成被抑制，从而减少黑曲霉胞外基质的形成，使黑曲霉在固定化的过程中不会形成过多的生物膜影响传氧传质，从而显著的提升固定化发酵效果。
[0009]其中，原始黑曲霉为Aspergillus Niger ATCC12846。
[0010]其中，所述几丁质合酶转录调控基因MedA失活的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，未失活的几丁质合酶转录调控基因MedA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0011]为了解决上述第二个技术问题，本专利技术还公开了上述黑曲霉基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
[0012](1)提取原始黑曲霉ATCC12846的基因组DNA；
[0013](2)以步骤(1)所得基因组DNA为模板，扩增得到基因MedA的上游同源臂和下游同源臂；以质粒PAN7
‑
1为模板，扩增得到潮霉素抗性基因；以基因MedA的上游同源臂、下游同源臂和潮霉素抗性基因为模板，通过重叠延伸PCR扩增得到基因敲除片段；
[0014](3)将步骤(2)所得基因敲除片段导入黑曲霉原生质体中进行同源重组，即得几丁质合酶转录调控基因MedA失活的黑曲霉基因工程菌。
[0015]步骤(2)中，扩增基因MedA上游同源臂时以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为引物；扩增基因MedA下游同源臂时以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为引物；扩增潮霉素抗性基因时以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列为引物；重叠延伸PCR扩增基因敲除片段时以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列为引物。
[0016]步骤(2)中，所述基因MedA的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述基因MedA的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
[0017]为了解决上述第三个技术问题，本专利技术还公开了上述黑曲霉基因工程菌在发酵产柠檬酸中的应用，其以所述黑曲霉基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵制备柠檬酸。
[0018]其中，所述固定化发酵以多孔纤维材料作为固定化载体，优选为聚氨酯。
[0019]其中，所述固定化载体依次经碱浸泡和酸浸泡进行预处理，优选为将固定化载体用0.6
‑
1.8M的NaOH浸泡45
‑
90min，用水冲洗至pH为中性，在0.6
‑
1.8M HCl中浸泡45
‑
90min，用水冲洗至pH为中性，烘干，即得。
[0020]其中，所述固定化载体剪成大小相同，体积为0.5cm3的正方体块状。
[0021]其中，所述固定化发酵中固定化载体的用量为0.5
‑
3g/L发酵培养基，优选为2g/L发酵培养基。
[0022]其中，所述发酵中，发酵培养基的制备方法为：将玉米粉水溶液经液化酶于63
‑
72℃下保温38
‑
43min；再加热至88
‑
102℃，经液化酶酶解至碘液不变蓝，得到玉米粉液化液；过滤，得到玉米清液；将所得玉米清液与所述玉米粉液化液混匀，即得；优选为，将220
‑
280g/L玉米粉水溶液经液化酶(0.5
‑
1.5mL/L玉米粉水溶液)于63
‑
72℃下保温38
‑
43min；再加热至88
‑
102℃，经液化酶(0.6
‑
1.5mL/L玉米粉水溶液)酶解至碘液不变蓝，得到玉米粉液化液；过滤，得到玉米清液；将所得玉米清液与所述玉米粉液化液按100:(4
‑
8)的体积比混匀，即得。
[0023]其中，所述液化酶中含有α
‑
淀粉酶，所述α
‑
淀粉酶的酶活为72000
‑
78000U/mL(1mL
extraction kit)，具体方法如下：
[0044]1.将刮取的黑曲霉ATCC128本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株黑曲霉基因工程菌，其特征在于，该菌株中几丁质合酶转录调控基因MedA失活。2.根据权利要求1所述黑曲霉基因工程菌，其特征在于，原始黑曲霉为Aspergillus Niger ATCC12846。3.根据权利要求1所述黑曲霉基因工程菌，其特征在于，所述几丁质合酶转录调控基因MedA失活的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.权利要求1
‑
3中任意一项所述黑曲霉基因工程菌在发酵产柠檬酸中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，以所述黑曲霉基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵制备柠檬酸。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述固定化发酵以多孔纤维材料作为固定化载体。7.根据权利要求6述应用，其特征在于，所述固定化载体依次经碱浸泡和酸浸泡进行预处理。8.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：余斌，应汉杰，陈勇，刘庆国，赵南，邹亚男，周勇，卢宗梅，熊结青，杨儒文，陈天鹏，孙文俊，张涛，姚建忠，
申请(专利权)人：南京高新工大生物技术研究院有限公司中粮生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：